[發明專利]一種基于CRISPR/Cas9體系的同源修復載體構建方法

在審

• 申請號: 201710981059.7
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN107937427A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 歐陽樂軍;李莉梅;徐錫榮;劉雅麗;柳鏡炬;梁裕華
• 申請（專利權）人: 廣東石油化工學院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/82
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司44228
• 代理人: 李慧

1.一種基于CRISPR/Cas9體系的同源修復載體構建方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)靶位點設計

sgRNA靶位點的選擇使用CRISPR在線設計工具，以擬南芥AS基因：序列1為靶基因，選擇靠近5'端得分最高的G-N19-NGG 23bp序列，其中第一個G是小RNA轉錄的起始信號位點，NGG是Cas9基因定位的PAM序列，需要插入gRNA載體的是G-N19共20bp序列，共設計兩個打靶位點的Target，實現大片段敲除；同時在AS基因的打靶載體上裝入AS基因的同源修復片段，實現AS基因在CAS9敲除的同時，以載體上的AS基因的同源臂做模板進行修復；

(2)進行引物設計

As-gRNA-F序列2：

CTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGCGGGATCACTGGGTTAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

As-gRNA-R序列3：

TGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCTCACCATCCTTCTTCATC

AATCTCTTAGTCGACTCTA

EcoR1-F序列4：

TAATTGATTGACAACGAATTGCGCAGCTGCAGCCACTGTG

EcoR1-R序列5：

ACAGCTATGACATGATTACGGGGAAGAAGTGATGTCAGGA

μ626-IDF序列6：

TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC

(3)打靶載體PHDE-ASgRNA的構建

①PCR擴增目的片段：PCR反應總體積共100μL，平均分裝至2個PCR小管；PCR反應條件為98℃預熱4min，40個循環98℃45s，55℃10s，72℃30s，72℃保溫；

②瓊脂糖凝膠電泳純化與目的片段回收：1.5％瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，在紫外透照臺上切下目的條帶，將目的條帶裝入1.5mL EP管，-4℃冷凍20min，15000rpm低溫離心20min，吸取上清液于PCR小管中，測定濃度，記錄OD₂₆₀/OD₂₈₀，-20℃保存；

③PHDE質粒的酶切和鑒定：酶切體系總體積20μL，50℃恒溫過夜，然后以酶切前的PHDE質粒作對照，配制0.5％的瓊脂糖凝膠進行電泳分析；

④目的片段與載體重組：取一個PCR小管，先后加入0.3μL線性化PHDE載體、3μL重組酶以及1.2μL回收的AS基因片段，采用重組酶技術，將回收純化后的AS基因片段與BsaI酶切線性化的載體重組連接，組裝條件為50℃恒溫反應1h；

⑤重組子轉化與鑒定：將重組產物利用熱擊法轉化DH5a感受態大腸桿菌，復蘇培養12h，挑單菌落搖床培養3～4h，做菌液PCR鑒定，用0.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR反應條件為：94℃3min，30個循環94℃30S，55℃30S,72℃45S，72℃2min；

⑥重組質粒的提取和鑒定：將陽性克隆過夜培養后用堿裂解法提取質粒，測定濃度，記錄OD₂₆₀/OD₂₈₀，以該質粒為模板進行PCR分析，用1.2％濃度的瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，0.5％濃度的瓊脂糖凝膠電泳提取的重組質粒；

⑦重組質粒送樣測序：將質粒PCR鑒定為陽性的質粒送至生工廣州分公司測序驗證，測序引物為Μ626-IDF；

(4)同源重組修復模板載體PHDE-ASgRNA-AS的構建

①PCR擴增AS基因同源臂片段：PCR反應體系與前述相同，總體積共100μL，混勻后平均分裝至2個PCR小管，PCR反應條件為98℃預熱4min，40個循環98℃45s，55℃10s，72℃30s，72℃保溫；

②瓊脂糖凝膠電泳純化與目的片段回收：將1.5％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的條帶，測濃度，記錄OD₂₆₀/OD₂₈₀，-20℃保存；

③PHDE-ASgRNA質粒的酶切和鑒定：酶切體系總體積20μL，37℃恒溫反應15min，用0.5％瓊脂糖凝膠進行電泳分析；

④目的片段與載體重組：取PCR小管，先后加入0.3μL線性化PHDE-ASgRNA載體、3μL重組酶以及1.2μL回收的同源臂片段，組裝條件為50℃恒溫反應1h；

⑤重組子轉化與鑒定：將重組產物利用熱擊法轉化DH5a感受態大腸桿菌，復蘇培養12h，挑單菌落搖床培養3～4h，做菌液PCR鑒定，用0.5％瓊脂糖凝膠電泳分析；PCR反應條件為：94℃3min，30個循環94℃30S，55℃30S,72℃45S，72℃2min；

⑥重組質粒的提取和鑒定：將陽性克隆過夜培養后提取質粒，測定濃度，記錄OD₂₆₀/OD₂₈₀，以該質粒為模板進行PCR分析，用1.2％濃度的瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，0.5％濃度的瓊脂糖凝膠電泳提取的重組質粒；

⑦重組質粒送樣測序：將質粒PCR鑒定為陽性的質粒送樣到生工廣州分公司測序，測序引物為EcoR1-F。