[發明專利]一種高效檢測EGFRT790M突變體的方法以及用于檢測的探針和試劑盒

在審

• 申請號: 201710980221.3
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107513577A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 陳莉莉;王焱
• 申請（專利權）人: 南京科維思生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所32237
• 代理人: 楊文晰

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高效測定表皮生長因子受體(EGFR)T790M突變體的方法。

背景技術

表皮生長因子受體家族(epidermal growth factor receptor family,EGFR家族)屬于酪氨酸激酶受體家族，它在調節癌細胞增殖和存活中起著重要作用，EGFR在多種腫瘤細胞內表達，而其高表達通常與腫瘤的不良預后有關，EGFR因此被作為靶向治療實體瘤的靶標，已開發的抑制EGFR的酪氨酸激酶活性的腫瘤藥物有吉非替尼(Iressa)和厄洛替尼(Tarceva)。EGFR被認為與肺癌有關，然而，酪氨酸激酶抑制劑藥物Iressa或Tarceva只對少部分的非小細胞肺癌(NSCLC)患者有作用，研究發現酪氨酸激酶抑制劑的治療效果與EGFR基因的突變有關，有一類EGFR的突變會增強NSCLC患者對酪氨酸激酶抑制劑藥物的敏感性，稱為EGFR的致敏性突變，比如EGFR的L858R點突變和外顯子19中的多核苷酸框內缺失突變，而另一類的突變(如EGFR T790M點突變)則使得癌癥患者產生抗藥性，被稱為抗藥性突變。因此通過檢測EGFR基因突變來預測吉非替尼等靶向藥物治療NSCLC患者的有效性，以及監控患者在治療過程中產生的獲得性耐藥是臨床實踐中切實可行的診斷方法，對于實現對腫瘤病人的有效的個性化治療有著重要的作用。

目前常用的基因突變檢測方法有測序法和Amplification Refractory Mutation System PCR(ARMS-PCR)方法，這兩種方法都存在一定的缺陷。測序法是通過測量樣品中的突變體的核苷酸順序來檢測突變體的存在，該方法靈敏度較低約20％，且操作復雜，檢測時間較長，假陰性率較高。ARMS-PCR方法采用突變序列特異性引物來選擇性的擴增樣品中的EGFR突變體，這個方法的靈敏度可達到1％，能夠滿足腫瘤組織樣本的檢測需求，但是對于檢測血液樣本的循環腫瘤DNA，其含量低于1％，ARMS-PCR方法不足以對血液進行檢測，局限了臨床醫生對靶向藥物療效的判斷，也不能對用藥過程中產生的耐藥性突變的進行有效的跟蹤檢測。本發明提供一種靈敏度高、特異性強、簡便易行的EGFR突變檢測方法，可以解決這方面的急需。

癌癥血液檢測是通過分析血液中的游離腫瘤脫氧核糖核酸(circulating tumor DNA，ctDNA)片段，對患者進行早期診斷和監測癌癥發展演變的技術。這種技術成本低、易操作，并可避免傳統侵入性組織活檢所帶來的痛苦，有望替代常規活檢，成為新型的“分子聽診器”。然而，要使癌癥血液檢測成為臨床實踐中可常規使用的技術還存在著巨大的技術挑戰，血液中的ctDNA片段的含量很低，其中腫瘤DNA的所占的比例通常<1％，甚至只有0.1％，需要開發高靈敏性，高特異性的檢測技術，而且同時還要具有操作簡單，成本低，可重復度高的特點。本發明采用單核苷酸延伸及連接的方法特異性地選擇樣品中的EGFR突變體，加以選擇性擴增后，采用針對突變體的高特異性探針來檢測突變體，可以極大的提高檢測的特異性和靈敏度，能夠有效檢測低樣品中含量的突變體，特別適合于檢測血液樣品中低含量的游離腫瘤DNA突變體。本發明的另一個特點的是常采用EGFR的非突變的外顯子區做為內標，可以定量檢測EGFR的T790M突變體在總體EGFR中所占的相對比例。本發明的另一個特點是采用簡并序列的突變體探針，可以涵蓋EGFR T790M突變位點附近的兩個單核苷酸多態(SNP)序列，有效的提高EGFR T790M突變體的檢出率。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種特異性強，高靈敏度的測定EGFR T790M突變體的方法，這個方法特別適用于檢測血液樣品中的低含量的游離腫瘤DNA，而且可以定量測定EGFR T790M突變體的相對含量。本發明包括兩個主要部分：采用單核苷酸延伸和連接反應來選擇性捕捉EGFR突變體信息，和采用數字PCR的方法和高特異性探針來有效檢測樣品中的突變體。

(一)單核苷酸延伸及連接反應選擇性捕捉EGFR突變體信息