[發(fā)明專利]一種高效檢測(cè)EGFRT790M突變體的方法以及用于檢測(cè)的探針和試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710980221.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-19
• 公開（公告）號(hào): CN107513577A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳莉莉;王焱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京科維思生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所32237
• 代理人: 楊文晰

1.用于檢測(cè)EGFR T790M突變體的探針，其特征在于，所述探針包含如下的序列的任何一個(gè)或是如下任一序列的子序列：

1）如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，該序列距5'端第9、10、11位堿基為鎖核酸修飾堿基；

2）如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，該序列距5’端第10、11位堿基為鎖核酸修飾堿基，且距5’端第9位堿基為2-氨基脫氧腺苷酸修飾堿基；

3）如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，該序列距5’端第8、9、10位堿基為鎖核酸修飾堿基；

4）如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，該序列距5’端第8、10位堿基為鎖核酸修飾堿基，且距5’端第9位堿基為2-氨基脫氧腺苷酸修飾堿基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)EGFR T790M突變體的探針，其特征在于，所述序列的5' 端加有FAM，HEX或是VIC熒光標(biāo)記基團(tuán)。

3.一種高效測(cè)定EGFR T790M突變體的方法，其特征在于, 采用EGFR突變體捕捉引物雜交，單核苷酸延伸和DNA連接的方法識(shí)別樣品中的EGFR T790M 突變體，并將其轉(zhuǎn)化成含有突變位點(diǎn)的捕獲序列，運(yùn)用針對(duì)突變位點(diǎn)的特異性探針和PCR擴(kuò)增檢測(cè)有突變位點(diǎn)的捕獲序列， 從而檢測(cè)樣品中EGFR T790M 突變體的存在，其中單核苷酸是與突變堿基互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸，突變體捕捉引物含有EGFR特異序列和與EGFR序列無(wú)關(guān)的PCR引物序列兩部分，其EGFR特異性序列與T790M突變位點(diǎn)附近的同一條靶序列互補(bǔ)，雜交后的上游和下游捕捉引物之間只相差一個(gè)核苷酸，即突變核苷酸；所述突變位點(diǎn)是指EGFR T790M序列第2369位堿基；所述突變核苷酸是指EGFR T790M序列第2369位堿基由C突變?yōu)門的核苷酸。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在單核苷酸延伸和DNA連接反應(yīng)中，同時(shí)加入與野生型EGFR完全互補(bǔ)的阻斷序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在單核苷酸延伸和DNA連接反應(yīng)中，同時(shí)加入與相應(yīng)于突變位點(diǎn)的EGFR的野生型堿基互補(bǔ)的雙脫氧核糖核苷酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，單核苷酸是dTTP 或 dUTP, 且突變體捕捉序列如下：上游捕捉序列如SEQ ID NO.5所示，下游捕捉序列如SEQ ID NO.6所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，與野生型EGFR完全互補(bǔ)的阻斷序列如SEQ ID NO.7所示，該序列距5’端第19、20、21位堿基為鎖核酸修飾堿基。

8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，在單核苷酸延伸和DNA連接反應(yīng)中， 同時(shí)加入雙脫氧核糖核苷酸ddCTP。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，包含以下操作步驟：

DNA樣品加入含上游捕捉序列，下游捕捉序列，阻斷序列，dTTP, ddCTP, DNA聚合酶，DNA連接酶的緩存液中；

上游捕捉序列和下游捕捉序列結(jié)合到EGFR T790M 突變體序列上， 以EGFR T790M為模板，從上游捕捉序列延伸單個(gè)核苷酸dTTP，由DNA連接酶連接相鄰的上游和下游捕捉序列產(chǎn)生一條含有突變位點(diǎn)的捕獲序列，該捕獲序列的兩端帶有與EGFR序列無(wú)關(guān)的PCR引物序列；

依捕獲序列兩端的PCR引物序列進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)生捕獲序列，運(yùn)用針對(duì)突變位點(diǎn)的特異性探針檢測(cè)有突變位點(diǎn)的捕獲序列。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述特異性探針的序列是權(quán)利要求1中的任一條序列。

11.根據(jù)權(quán)利要求9的所述方法，特征在于，所述的PCR反應(yīng)是常規(guī)PCR，實(shí)時(shí)定量PCR或是數(shù)字PCR。

12.一種測(cè)定EGFR T790M突變體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1中的EGFR T790M突變體的探針。

13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括權(quán)利要求3中的EGFR突變體捕捉序列，dTTP， ddCTP，野生型EGFR的阻斷序列，DNA聚合酶和DNA連接酶。

14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶是缺乏3' -> 5' 外切酶活性的 Taq DNA聚合酶，DNA連接酶是高特異性的Ampligase。