[發明專利]一種黃鱔精子超低溫冷凍保存液及其冷凍復蘇方法

有效

• 申請號: 201710980208.8
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107683850B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 呼光富;秦向鋒;劉香江;李忠;葉城;王衛民;肖亞倩;周小云;鄒桂偉
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發明屬于生物技術領域，具體公開了一種黃鱔精子超低溫冷凍保存液及其冷凍復蘇方法，首次建立了適用于黃鱔的精子超低溫冷凍保存方法，冷凍復蘇后的精子能夠用于人工授精，每次復蘇后精子的活力都能夠達到40%?50%；用復蘇后的精子進行人工授精的受精率和孵化率分別都能達到90%以上和80%以上，本發明提供的冷凍保存液及冷凍復蘇方法為黃鱔人工繁殖和遺傳育種奠定基礎；本發明對儀器要求低，成本也很低，可用于規模化生產，具有重大的推廣意義，為今后黃鱔工廠化育苗和良種的選育提供幫助，在黃鱔種質資源的保存和生物多樣性的保護研究方面意義重大。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種黃鱔精子超低溫冷凍保存液及其冷凍復蘇方法。

背景技術

精子超低溫冷凍保存技術在種質資源保存、遺傳育種及苗種生產上具有重要的應用價值。為提高冷凍精子的實際應用效果，需要在提高凍精質量和復蘇效率上進行深入研究。凍精質量的提高有賴于精子超低溫冷凍保存技術參數的優化，諸如稀釋液種類、稀釋比例、抗凍劑種類及濃度、降溫方法及速率等技術參數均需要進行研究與優化選擇。目前，淡水魚類精子超低溫冷凍保存研究已見在四大家魚、黃顙魚等種類中報道；其使用的稀釋液種類主要有任氏液、Cortland和HBSS等，稀釋比例一般在1:1-1:9；采用的抗凍劑種類主要有DMSO、乙二醇、甘油和丙二醇等，其適用濃度一般為5％-20％；采用的降溫方法有程序性降溫儀降溫法或自制簡易降溫裝置降溫法。為了評價精子的超低溫冷凍保存效果，需對凍精質量進行檢測與分析，常用檢測方法有精子活力檢測法、酶活性檢測法、單細胞凝膠電泳DNA損傷檢測法、流式細胞儀檢測細胞結構損傷等等，根據實際研究條件選擇應用。

黃鱔(Monopterusalbus)又名鱔魚，合鰓魚科黃鱔屬的一種魚類。其肉質鮮嫩，營養豐富，經濟價值高，深受國內外市場青睞。然而，目前黃鱔養殖產業化仍未真正形成，其主要原因是黃鱔苗種規模繁殖技術還沒有取得實質性突破。然而，就在2017年黃鱔的人工催產授精孵化已經取得突破，并日趨成熟，相信在未來兩年里黃鱔的工廠化育苗技術將得以實現，黃鱔養殖將真正實現產業化。目前，在人工繁殖過程中發現，雌性黃鱔的繁殖期可以從每年的五月份一直延續到八月底，然而雄性黃鱔的成熟期要從六月中旬到八月中旬左右，其中七月份的精子質量最好，這樣由于雄鱔精子質量不足而延誤了大約一個半月的繁殖期。所以黃鱔的精子冷凍保存技術就顯得尤為重要。如果我們能夠在雄鱔精子活力最好的七月份對其精液進行冷凍保存，等待八月中下旬和來年五月份復蘇后使用，將能夠使黃鱔的人工繁殖期從五月一直延續到八月底，使得苗種的工廠化生產得以實現。

黃鱔精子稀釋保存液已經有文章報道，但目前的報道有的只是闡述了一種黃鱔精子稀釋液，并不能用來對黃鱔精子進行超低溫冷凍保存，因此黃鱔精子在該稀釋液中4℃條件下最多也只能存活四天左右，并且在這個過程中精子活力也在不斷降低；雖然也有報道黃鱔精子冷凍保存的，在該報道中，作者使用冷凍麥管作為精子凍存容器，這種方法雖然有較好的凍存效果，但是其成本較高(一根0.25ml的麥管要1.5元)，并且操作起來比較麻煩，特別是在水浴中復蘇的時候，很容易浸入水使得精液失活，因而并不適于大批量保存和普通客戶使用，同時精子復蘇后，只能證明其能游動，能否授精依然不得而知。

針對上述問題，申請人提供了一種黃鱔精子超低溫冷凍保存液及其冷凍復蘇方法，利用本發明提供的保存液冷凍保存的黃鱔精子復蘇后，我們不僅證明其具有較好的活力，而且證明其能夠與黃鱔卵子進行體外授精，并發育出健康的黃鱔幼苗。

發明內容

本發明目的在于提供一種黃鱔精子超低溫冷凍保存液，利用該保存液，可使得黃鱔精子妥善保存，復蘇后不僅擁有活力，還能正常授精并發育出健康的黃鱔幼苗。

本發明的另一個目的是建立一套對設備依賴程度低，生產成本低，適用于推廣的規模化黃鱔精子冷凍保存與復蘇的方法，方法簡單。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：