[發明專利]植物作為宿主在表達凝血九因子中的應用

有效

• 申請號: 201710979577.5
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN109679985B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 王躍駒;馬潔
• 申請（專利權）人: 北京睿誠海匯健康科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/57;C12N9/64
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張柳;趙青朵

本發明涉及生物技術領域，特別涉及植物作為宿主在表達凝血九因子中的應用。本發明利用重組載體以及農桿菌介導真空滲透方法來表達人凝血九因子(anti?hemophilic factor(AHF),FIX)。該表達體系確定植物外源蛋白在農桿菌侵染4d后就可以收集。利用SDS?PAGE法、免疫印跡法(Western法)確定重組FIX成功表達。凝血實驗證明生菜生產的FIX具有生物學活性。本發明提供了一種低成本、方便、大量生產具有活性重組人FIX的方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及植物作為宿主在表達凝血九因子中的應用。

背景技術

人凝血九因子(FIX)學名為凝血酶原復合物(Prothrombin Complex，PCC)，全名凍干人凝血酶原復合物，俗稱九因子，為人體血漿制品，主要用于治療乙型血友病。FIX是非正常血液凝固所必需的非酶血漿蛋白。人類因子FIX活性的不足與先天性出血性疾病(稱為血友病B)有關。患者是因為缺乏凝血因子(大多數患者缺乏“八因子”，少數患者是缺乏“九因子”或“十一因子”)而流血不止，如得不到及時治療，發病癥狀為出血部位疼痛難忍、留下殘疾甚至死亡。乙型血友病屬X連鎖隱性遺傳病，約占血友病的10％。凝血因子IX替代療法是治療本病的根本措施，常見替代品有新鮮血液、血漿及濃縮凝血因子IX等。對嚴重患者給予預防替代療法可以預防自發性出血，還可以延緩慢性關節病惡化。

目前，我國市場上凝血九因子均為從血液中獲得，通過兩步滅活生產工藝提取凝血九因子。由于血源供應不足，導致凝血九因子產量遠遠達不到臨床的需求量，致使凝血九因子價格快速上漲。由于凝血因子VII、II等是與IX因子性質很相似的蛋白質，要獲得純的IX因子，還需要從凝血酶元復合物中作再次的分離，需要更為復雜的提純過程。而且，血漿中潛在的病原體如肝炎和艾滋病毒導致從目前從血漿中來源的凝血九因子存在各種風險。為了消除血漿病原體以及病毒污染的潛在風險，利用基因工程技術生產重組九因子(rFIX)可以作為大規模生產一種更安全以及低成本的FIX從而取代血漿來源的九因子。

植物作為藥物蛋白質的表達和生產系統，已經研究了近三十年。除了低成本和產量高等的優點外，基于植物的表達系統還降低了人和動物病原體從產生蛋白質的過程中傳播到人類的風險。此外，植物真核蛋白內膜表達系統和分泌途徑類似于哺乳動物細胞。植物表達系統可大量生產大分子量以及多亞基的藥物蛋白質，且大大優于原核生物表達系統，比如大腸桿菌表達系統。如需要翻譯后修飾的，糖基化的蛋白，以及需要組裝的單克隆抗體，其不能用原核系統實現。利用植物生產的藥用蛋白作為生物試劑已經商業化，或用作家禽的疫苗添加劑。2012年，美國食品和藥物管理局(FDA)批準了用于治療遺傳疾病1型戈謝病的蛋白ELELYSO^TM(taliglucerase alfa)，而這種蛋白是利用胡蘿卜生產的。在過去十年中，人們對藥物蛋白質的需求急劇增加，所以FDA批準用于臨床試驗的植物藥用蛋白質的數量也在不斷增加。

植物瞬時表達系統可以大量生產重組蛋白用于臨床研究或者應對突發性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆發的抗體治療藥物，ZMappTM，就是農桿菌滲透方法在煙草葉片中生產。ZMapp的功效和安全性為推動植物制藥業的行業開辟了道路。目前，煙草瞬間蛋白表達最常見的宿主植物，并且已經開發了各種載體和農桿菌滲透方法，用于在短時間內進行大規模生產。然而，煙草具有高纖維含量和潛在的有毒化合物，如生物堿尼古丁，顯著增加了下游純化過程中的成本，極大地阻礙了植物外源蛋白藥物的進一步發展。與煙葉系統相比，生菜中含有更少的酚類和有毒化合物，因此，將生菜作為宿主在表達人凝血九因子具有重要的現實意義。

發明內容

有鑒于此，本發明提供植物作為宿主在表達凝血九因子中的應用。本發明利用生菜作為重組蛋白生產的有效平臺，消除了植物生長周期，大大節省了前期培育植物的時間。本發明用生菜系統表達了凝血九因子(FIX)，并且在溫和的條件下成功分離出有活性的外源蛋白，證明生菜表達平臺可以用來生產重組人凝血九因子。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：