[發(fā)明專利]一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴(kuò)增熒光定量方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710978275.6
• 申請日: 2017-10-18
• 公開（公告）號: CN108130382A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧潮江;張同存
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

一種檢測整合HIV?1病毒基因組的核酸擴(kuò)增熒光定量方法及其應(yīng)用，該方法包括如下步驟：1)建立實(shí)時(shí)絕對定量HIV總DNA的方法；2)制備用于整合HIV基因組的標(biāo)準(zhǔn)品并采用步驟1)方法定量；3)梯度稀釋整合HIV的標(biāo)準(zhǔn)品，巢式熒光定量PCR建立HIV整合標(biāo)準(zhǔn)曲線；4)同時(shí)準(zhǔn)備HIV整合標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，每個(gè)待測樣品設(shè)立無Alu引物參照管，經(jīng)步驟3)的PCR操作，待測樣品擴(kuò)增結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對得出待測樣品的絕對拷貝數(shù)，待測樣品整合HIV前病毒的拷貝數(shù)等于有Alu引物樣品與無Alu引物的參照管的拷貝數(shù)之差。該方法能區(qū)分整合和非整合的HIV病毒基因組，特異性檢測前病毒并具有極高的靈敏度(5?10拷貝/μl)，為準(zhǔn)確評估HAART治療效果和精確定量HIV病人體內(nèi)病毒儲藏庫提供技術(shù)保證。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及診斷領(lǐng)域，具體涉及一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴(kuò) 增熒光定量方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus 1，HIV-1)感染引起的一種重大威脅人類生命安全的傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì), 自發(fā)現(xiàn)到2014年底已造成3900多萬人死亡，目前世界上艾滋病毒感染者仍有 3700萬。

要遏制與防治艾滋病首要前提是快速、高效的診斷和檢測。目前檢測HIV的 方法有100多種，總體來說分為血清學(xué)診斷和病毒學(xué)診斷。血清學(xué)檢測是早期HIV 診斷的主要方法，通過檢測HIV的抗體間接地診斷HIV感染。酶聯(lián)免疫法作為診 斷艾滋病的一個(gè)主要手段目前已經(jīng)普遍用于臨床、急診、血液篩查等各個(gè)領(lǐng)域。 但是抗體通常是在感染后3～8周才能夠被檢測出來，因此酶聯(lián)免疫方法本身決 定了其是一種間接滯后的檢測方法，原因是檢測的目標(biāo)是人體內(nèi)產(chǎn)生的抗體而 不是病原體本身。

HIV感染的病毒學(xué)診斷技術(shù)常用方法為共培養(yǎng)法、p24抗原檢測和病毒核酸 檢測，即用正常人外周血液分離單個(gè)核細(xì)胞，加PHA和IL-2刺激并培養(yǎng)后，加入 病人外周血單核細(xì)胞(PMBC)進(jìn)行艾滋病的診斷。該方法必須要有一定數(shù)量的 感染細(xì)胞存在才能培養(yǎng)和分離出病毒來，因而敏感性差、操作時(shí)間長、操作復(fù) 雜、必須在特定的P3實(shí)驗(yàn)室中才能進(jìn)行，且費(fèi)用較高，不適用于臨床。另外，p24抗原檢測能夠在病毒開始復(fù)制后檢測到血液中的可溶性p24抗原，但易出現(xiàn) 假陽性。因此，陽性結(jié)果必須經(jīng)中和試驗(yàn)確認(rèn)，該結(jié)果才可作為HIV感染的輔助 診斷依據(jù)。HIV-1p24抗原檢測陰性，只表明在本試驗(yàn)中無反應(yīng)，不能排除HIV感染。

近年來核酸分子檢測技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)和臨床研究中顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢，相 比較酶聯(lián)免疫診斷技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、診斷快速等優(yōu)點(diǎn)。近些來， 病毒核酸分子檢測通常是通過檢測HIV RNA水平來反映病毒載量，具有很高的靈 敏度，使用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)技術(shù)，能夠在HIV感染的前 兩周檢測到病毒核酸。該方法已成為一種通用艾滋病臨床檢測方法，大大提高 了艾滋病的檢測準(zhǔn)確性，促進(jìn)了疾病的早期診斷，可極大縮短“窗口期”。在 遏制與防治艾滋病過程中，對高危人群的診斷是“防艾”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而核酸 診斷試劑在確診艾滋病病毒攜帶者的過程中發(fā)揮了重要作用，目前，已經(jīng)成為艾滋病確診的金標(biāo)準(zhǔn)試劑。