[發明專利]一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴增熒光定量方法及其應用

在審

• 申請號: 201710978275.6
• 申請日: 2017-10-18
• 公開（公告）號: CN108130382A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 顧潮江;張同存
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴增熒光定量方法，其特征在于：所述方法對整合HIV的定量包括如下步驟：1)在HIV病毒序列高保守Gag區設計并合成PCR擴增引物和TaqMan探針，以梯度稀釋的已知拷貝數的質粒DNA為模板，建立實時絕對定量HIV總DNA的方法；2)制備用于整合HIV基因組的標準品并采用步驟1)的方法定量；3)梯度稀釋整合HIV的標準品，經巢式熒光定量PCR建立HIV整合標準曲線；4)同時準備HIV整合標準品和待測樣品，以無Alu引物的待測樣品為參照樣品，經與步驟3)同樣的巢式熒光定量PCR操作，與標準曲線比對并讀出待測樣品的絕對拷貝數，待測樣品整合HIV前病毒的拷貝數等于有Alu引物樣品與無Alu引物的參照樣品的拷貝數之差。

2.根據權利要求1所述的一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴增熒光定量方法，其特征在于：所述步驟1)中在HIV病毒序列高保守Gag區設計的PCR擴增的上游引物序列為：5'–tgggaccacaggctacactaga–3'(SEQ ID NO.1)，PCR擴增的下游引物序列為：5'–cagccaaaactcttgctttatgg–3'(SEQ ID NO.2)；TaqMan探針序列為：5'–tgatgacagcatgccagggagtgg-3'(SEQ ID NO.3)，探針5'端標記為FAM熒光發生基團，3'端標記為MGBNFQ熒光淬滅基團。

3.根據權利要求1所述的一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴增熒光定量方法，其特征在于：所述步驟1)的PCR擴增的最佳反應溫度和時間為：95℃5min，1個循環；94℃10s，60℃30s，40個循環采集熒光信號。

4.根據權利要求1所述的一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴增熒光定量方法，其特征在于：所述步驟2)中制備并定量用于整合HIV基因組的標準品的具體方法為：構建囊膜gp120缺陷的HIVNL4-3質粒并與水泡性口炎病毒(VSV-G)囊膜質粒共轉染包裝假病毒，以此假病毒感染人表皮T細胞系H9，經體外傳代20代后，提取細胞總DNA并制備用于整合HIV基因組的標準品，然后采用步驟1)的方法進行定量。

5.根據權利要求4所述的一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴增熒光定量方法，其特征在于：所述用于整合HIV基因組的標準品的濃度線性范圍為10¹-10⁶拷貝數/μl，DNA濃度為10⁶拷貝數/μl的標準品經10倍連續稀釋同時加入未感染細胞的DNA，使每個濃度的HIV整合定量標準品中的細胞DNA濃度都與10⁶拷貝數/μl對應的標準品中DNA濃度相同。

6.根據權利要求1所述的一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴增熒光定量方法，其特征在于：所述步驟3)中巢式熒光定量PCR的具體方法為：梯度稀釋整合HIV的標準品，分別選定人類基因組中的Alu序列和HIV病毒序列高保守gag區作為目標擴增區，利用ABIPrimer expression3.0設計并合成互相作為PCR擴增的錨定引物，進行第一輪PCR預擴增；選定5’LTR保守區域，設計一對引物和與之匹配的TaqMan探針，分別以第一輪預擴增后的標準品和擴增產物作為第二輪熒光定量PCR的標準品和待測樣品，進行第二輪熒光定量PCR，建立HIV整合標準曲線。

7.根據權利要求6所述的一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴增熒光定量方法，其特征在于：所述第一輪PCR預擴增使用高保真的大片段擴增的熱啟動Taq DNA聚合酶。

8.根據權利要求6所述的一種檢測整合HIV-1病毒基因組的核酸擴增熒光定量方法，其特征在于：所述第一輪PCR預擴增的下游引物序列為5'-tcacacaacagacgggcacacac-3'(SEQID NO.4)，第一輪PCR預擴增的上游引物序列為5'-tgctgggattacaggcgtgag-3'(SEQ IDNO.5)和5'-cgagaccatcctggctaacacg-3'(SEQ ID NO.6)。