[發明專利]一種固定化葡萄糖氧化酶的制備方法

在審

• 申請號: 201710977699.0
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107502598A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 蔣文明;李璐;尹凱欣
• 申請（專利權）人: 蔣文明
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N11/02;C12N11/08
• 代理公司: 北京風雅頌專利代理有限公司11403
• 代理人: 馬驍

技術領域

本發明屬于食品保鮮食品添加劑領域，具體涉及一種固定化葡萄糖氧化酶的制備方法。

背景技術

葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶。葡萄糖氧化酶是從特異青霉等霉菌和蜂蜜中發現的酶。葡萄糖氧化酶以氧為電子接受體，能專一地氧化β-D-葡萄糖為葡萄 糖酸和過氧化氫。葡萄糖氧化酶是酶應用技術領域中一種非常重要的酶，作為 國家允許使用的酶制劑之一，它在食品、醫藥、飼料等行業中得到了廣泛應用。

葡萄糖氧化酶在生物界分布很廣泛，其工業化生產是利用微生物發酵法生產，最常見的葡萄糖氧化酶來源是通過黑曲霉、青霉以及酵母菌屬的發酵得來。多數商業化的葡萄糖氧化酶是從黑曲霉的菌絲體中分離得到的。但是由于黑曲霉的發酵主要是用作生產葡萄糖酸或者葡萄糖酸鹽的，比如葡萄糖酸鈉、葡萄糖酸鈣，因此葡萄糖氧化酶主要是作為一種副產物出現，而這導致葡萄糖氧化酶 的生產酶活并不高，很多都是只有個位數的酶活，因此微生物發酵法存在發酵活力低、產量低、生產成本高等限制性因素。

因此，有必要發明一種酶活高，穩定性高，回收率高的固定化葡萄糖氧化酶。以此來適應于市場的需求。

發明內容

本發明所要解決的技術問題：本發明的目的是針對一般葡萄糖氧化酶的機械強度差，酶活性不高，不能重復利用的問題，利用一種環保的葡萄糖氧化酶的獲取途徑，通過包埋法和交聯法的共同作用，得到一種固定化葡萄糖氧化酶的制備方法。

為解決上述技術問題，本發明采用如下所述的技術方案是：

一種固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟：

（1）取田園土放入裝有生理鹽水的錐形瓶中振蕩混勻，取質量分數為0.9%生理鹽水稀釋土樣至10^-5稀釋度，移液管吸取稀釋渾濁液，涂布于篩選平板培養，挑取菌落與生理鹽水按質量比1:9混合，得混合菌液，取菌液接種至真菌平板培養基上培養，通過菌落，種子菌株；

（2）挑取上述的種子菌株劃線接種于斜面培養基培養，得培養物，將培養物加入聚山梨酯80與pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液混合均勻，將孢子洗脫，得去孢子混合菌液，將去孢子混合菌液接種至真菌種子液培養基中，培養得一級種子液；

（3）將一級種子液接種至發酵培養液中，發酵得二級種子液，在發酵罐中加入發酵液，通入蒸汽進行實罐滅菌，降溫，倒入二級種子液，并加入甘露糖，醋酸乙烯酯混合均勻，進行發酵，發酵完成后，得葡萄糖氧化酶發酵液；

（4）葡萄糖氧化酶的分離與提純：將葡萄糖氧化酶發酵液離心去除菌絲體收取上清液，并過微濾膜去除殘留的顆粒和菌體，取上清液，透析1天后收集粗酶液，取粗酶液上離子交換層析柱，用NaCl溶液進行梯度洗脫，層析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脫鹽，冷凍干燥，將冷凍干燥后的葡萄糖氧化酶加水稀釋，再次放入離子交換層析柱中，用DTT緩沖溶液進行洗脫，層析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脫鹽，冷凍干燥得到葡萄糖氧化酶粉末；

（5）葡萄糖氧化酶的固定化:將上述干燥的葡萄糖氧化酶粉末與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混合均勻，過濾，取過濾液，將聚乙烯醇、甲苯、氯仿、濾液混合均勻后加入反應容器，在反應容器中分別加入二氨基丙腈和過硫酸鉀， 用攪拌器持續攪拌，在20～40℃的水浴中反應，加入N₂作為保護氣，反應，過濾，濾液，收集濾渣，分別用PBS緩沖溶液，碳酸氫鈉溶液對濾渣進行洗滌，再用雙重氮聯苯胺溶液對濾渣交聯處理40min，再使用蒸餾水沖洗，干燥，即得到固定化葡萄糖氧化酶。

所述步驟（1）中田園土與生理鹽水混合的質量比為1:9。

所述步驟（2）中種子菌株接種于斜面培養基的培養條件為在20~25℃溫度條件下，培養5~7天，培養物、聚山梨酯80與pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的質量比為100:15:300，一級種子液的培養條件是在23~28 ℃溫度條件下，培養18~24 h。

所述步驟（3）中一級種子液與發酵培養液的質量比為1:6，發酵條件為pH3.5~6.5，23~ 28℃，發酵60~72h，發酵罐中加入的發酵液與發酵罐的體積比為1:2，倒入的二級種子液的接種量為10%，二級種子液、甘露糖、醋酸乙烯酯三種物質的質量比為2:1:1，在25~28℃的溫度條件下，發酵36~72h得到葡萄糖氧化酶發酵液，測定含有酶活為4.5~5.6U。

所述步驟（4）中平衡溶液為pH7.1±0.2，濃度為0.05mol/L的DTT緩沖溶液，進行梯度洗脫的是濃度為0.1~1mol/L NaCl溶液，冷凍干燥葡萄糖氧化酶與水混合的質量比為1:2。