[發(fā)明專利]一種固定化葡萄糖氧化酶的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710977699.0
• 申請(qǐng)日: 2017-10-19
• 公開（公告）號(hào): CN107502598A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣文明;李璐;尹凱欣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蔣文明
• 主分類號(hào): C12N9/04
• 分類號(hào): C12N9/04;C12N11/02;C12N11/08
• 代理公司: 北京風(fēng)雅頌專利代理有限公司11403
• 代理人: 馬驍

1.一種固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟：

取田園土放入裝有生理鹽水的錐形瓶中振蕩混勻，取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%生理鹽水稀釋土樣至10^-5稀釋度，移液管吸取稀釋混合液，涂布于篩選平板培養(yǎng)，挑取菌落與生理鹽水按質(zhì)量比1:9混合，得混合菌液，取菌液接種至真菌平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選取菌徑最大的菌落作為種子菌株；

挑取上述的種子菌株劃線接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，得培養(yǎng)物，將培養(yǎng)物加入聚山梨酯80與pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液混合均勻，將孢子洗脫，得去孢子混合菌液，將去孢子混合菌液接種至真菌種子液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得一級(jí)種子液；

將一級(jí)種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵得二級(jí)種子液，在發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液，通入蒸汽進(jìn)行實(shí)罐滅菌，降溫，倒入二級(jí)種子液，并加入甘露糖，醋酸乙烯酯混合均勻，進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完成后，得葡萄糖氧化酶發(fā)酵液；

葡萄糖氧化酶的分離與提純：將葡萄糖氧化酶發(fā)酵液離心去除菌絲體收取上清液，并過(guò)微濾膜去除殘留的顆粒和菌體，取上清液，透析1天后收集粗酶液，取粗酶液上離子交換層析柱，用NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，層析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脫鹽，冷凍干燥, 將冷凍干燥后的葡萄糖氧化酶加水稀釋，再次放入離子交換層析柱中，用DTT緩沖溶液進(jìn)行洗脫，層析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脫鹽，冷凍干燥得到葡萄糖氧化酶粉末；

葡萄糖氧化酶的固定化:將上述干燥的葡萄糖氧化酶粉末與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混合均勻，過(guò)濾，取過(guò)濾液，將聚乙烯醇、甲苯、氯仿、濾液混合均勻后加入反應(yīng)容器, 在反應(yīng)容器中分別加入二氨基丙腈和過(guò)硫酸鉀， 用攪拌器持續(xù)攪拌，在20～40℃的水浴中反應(yīng)，加入N₂作為保護(hù)氣，反應(yīng)，過(guò)濾，收集濾渣，分別用PBS緩沖溶液，碳酸氫鈉溶液對(duì)濾渣進(jìn)行洗滌，再用雙重氮聯(lián)苯胺溶液對(duì)濾渣交聯(lián)處理40min，再使用蒸餾水沖洗，干燥，即得到固定化葡萄糖氧化酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟（1）中田園土與生理鹽水混合的質(zhì)量比為1:9。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物菌劑的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）中種子菌株接種于斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為在20~25℃溫度條件下，培養(yǎng)5~7天，培養(yǎng)物、聚山梨酯80與pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的質(zhì)量比為100:15:300,一級(jí)種子液的培養(yǎng)條件是在23~28 ℃溫度條件下，培養(yǎng)18~24 h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟（3）中一級(jí)種子液與發(fā)酵培養(yǎng)液的質(zhì)量比為1:6，發(fā)酵條件為pH3.5~6.5，23~ 28℃，發(fā)酵60~72h，發(fā)酵罐中加入的發(fā)酵液與發(fā)酵罐的體積比為1:2，倒入的二級(jí)種子液的接種量按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，為10%，二級(jí)種子液、甘露糖、醋酸乙烯酯三種物質(zhì)的質(zhì)量比為2:1:1,在25~28℃的溫度條件下，發(fā)酵36~72h得到葡萄糖氧化酶發(fā)酵液，測(cè)定含有酶活為4.5~5.6U。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟（4）中平衡溶液為pH7.1±0.2，濃度為0.05mol/L的DTT緩沖溶液，進(jìn)行梯度洗脫的是濃度為0.1~1mol/L NaCl溶液，冷凍干燥葡萄糖氧化酶與水混合的質(zhì)量比為1:2。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟（5）干燥的葡萄糖氧化酶粉末與pH4.5~5.6，濃度為0.2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混合的質(zhì)量比為1:5，將聚乙烯醇作為載體對(duì)游離酶進(jìn)行包埋，聚乙烯醇、甲苯、氯仿、濾液的質(zhì)量比2:5:8:5，二氨基丙腈和過(guò)硫酸鉀的質(zhì)量比為1:2，反應(yīng)形成的固定化酶顆粒直徑為100μm～200μm，用作交聯(lián)處理的物質(zhì)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的雙重氮聯(lián)苯胺溶液。