[發(fā)明專利]獲得甘蔗健康種苗的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710977035.4
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107517855A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發(fā)明（設計）人: 陳保善;溫榮輝;王鳳林;林垠孚;張莉娟
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G1/00;C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發(fā)明屬于甘蔗健康種苗高效繁育技術領域，尤其涉及一種獲得甘蔗健康種苗的方法。

背景技術

甘蔗是我國主要的糖料作物，甘蔗產量和含糖量是制約糖業(yè)發(fā)展的關鍵因素。甘蔗在種植過程中常受到高粱花葉病毒、甘蔗花葉病毒、甘蔗黃葉病毒、甘蔗桿狀病毒、宿根矮化病、甘蔗黑穗病和梢腐病等病害的危害，造成甘蔗產量和含糖量下降。

在生產上通常是以蔗莖作為種子進行無性繁殖，經多代無性繁殖后種莖攜帶各種病原物的比例大幅提高，導致甘蔗種莖種性退化嚴重，甘蔗產量和質量逐漸下降，給甘蔗產業(yè)造成巨大損失。此外，攜帶病原物的甘蔗也會作為毒源傳染其他健康甘蔗植株，危害進一步擴大。為此，設法獲得健康甘蔗種苗并對健康甘蔗種苗進行擴繁，以生產符合行業(yè)標準要求的合格甘蔗種莖是蔗糖產業(yè)健康發(fā)展迫切所需。因此，探尋簡單、高效、低成本的甘蔗健康種苗繁育方法已成為一個研究熱點。

目前莖尖脫毒是培育甘蔗健康種苗的主要方法，該方法以含病毒量相對低的甘蔗莖尖作為外植體進行組培快繁，然而這并不能徹底脫除甘蔗內的病毒，因此獲得健康種苗的概率不高。而且，該方法有一定的盲目性，且組培苗生產數量龐大，檢測成本過高，生產上很難實現大量樣本的檢測。另一種培育甘蔗健康種苗的方法是種莖溫水處理法，該方法將甘蔗種莖放置在50℃左右的溫水中浸泡一定時間，達到去除或鈍化病原物的目的，然而該法需要特定設備，耗時、費力、增加生產成本，并且還不能徹底去除病毒。此外，目前甘蔗健康種苗的擴繁多在沒有妥善保護措施的種苗繁育大田中進行。因此獲得的各級種苗無法避免受病毒害的再次感染，也無法保證蔗種的健康性；并且種苗的優(yōu)良種性退化嚴重，難以保障甘蔗健康種苗的可持續(xù)性產出。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種技術簡單、成本低廉、健康率高且可持續(xù)產出的獲得甘蔗健康種苗的方法，以期從源頭上保證所繁育的甘蔗種苗保持健康狀態(tài)。

為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術方案：

獲得甘蔗健康種苗的方法，對甘蔗植株分別進行SCBV、Lxx、SrMV、SCMV和ScYLV的PCR檢測，將檢測健康的甘蔗植株移種到具有隔離保護措施的網室大棚內，作為健康甘蔗種源以及為組培擴繁提供外植體材料。

PCR檢測按以下操作進行：先提取甘蔗植株葉片的DNA，檢測SCBV和Lxx，再對不帶SCBV和Lxx的樣品提取RNA，檢測SrMV、SCMV、ScYLV，以上病毒害均不帶者即為健康的甘蔗植株。

PCR檢測各病毒害的PCR引物分別為：

SrMV：F：ACAGCAGAWGCAACRGCACAAGC，R：CTCWCCGACATTCCCATCCAAGCC；

SCMV：F：AATCTTGAGGAATGCGGAAAAC，R：ATCGATAGGCCCACAAATGAGTCT；

ScYLV：F：AATCAGTGCACACATCCGAG，R：GGAGCGTCGCCTACCTATT；

SCBV：F：GATGGATGACTGTTTCAGAGGC，R：GAGGGATGGTAAGATTTGGC：

Lxx：1：CCGAAGTGAGCAGATTGACC，2：ACCCTGTGTTGTTTTCAACG。

上述獲得甘蔗健康種苗的方法，包括以下步驟：

A、健康甘蔗植株的篩選；

B、健康甘蔗植株的隔離保存；

C、健康外植體的培育；

D、健康種苗的擴繁。

步驟A按以下操作進行：從甘蔗種植大田中采集長勢良好、外觀沒有病害癥狀的甘蔗植株葉片，對這些甘蔗植株進行SrMV、SCMV、ScYLV、SCBV和Lxx病毒害檢測，先提取這些葉片的DNA，檢測SCBV和Lxx；再對不帶SCBV和Lxx樣品的樣品提取RNA，檢測SrMV、SCMV、ScYLV，以上病毒害均不帶者即為健康甘蔗。

步驟B按以下操作進行：將經檢測的健康甘蔗植株移種到具有隔離保護措施的網室大棚內。

步驟C按以下操作進行：

①外植體處理：去除蔗芽的外層老葉，經75％酒精消毒后放入滅菌的超凈臺，取芽尖2-3mm的生長點接種；或者用甘蔗頂端去除老葉的分生組織作為外植體，需先用75％酒精消毒15min，再經升汞消毒30min，蒸餾水翻轉震蕩洗滌3-4遍，每遍洗滌5min，將消毒后的分生組織放入滅菌的超凈臺，再去除1-2層老葉，將其切成1-2mm厚的薄片接種；