[發明專利]一種獲得高純度腺相關病毒載體的純化工藝

在審

• 申請號: 201710974674.5
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107630037A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發明（設計）人: 潘謳東;韋厚良;王立輝;胡惠忠;張立明;由慶睿;賈國棟
• 申請（專利權）人: 和元生物技術（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域和基因治療，尤其涉及一種大規模獲得高純度的2型腺相關病毒載體的純化工藝方法。

背景技術

基因治療是一種將外源基因安全穩定地導入病人體內的方法。進入細胞內，基因片段表達需要的產物實現治療效果。基因治療的關鍵在于選擇合適的基因載體。重組腺相關病毒載體（recombinant adeno-associated viral，rAAV）是目前公認的安全可靠性基因治療載體，可介導外源基因在體內長期穩定表達，而且免疫原性很低，具有廣闊的應用前景。

然而，限制rAAV使用的障礙之一是開發可放大的純化工藝。傳統的實驗室規模rAAV純化方法為超速離心，該方法的最大弊端在于難以放大至生產規模。層析技術和膜分離技術作為現代純化方法的代表，已廣泛應用于生物制藥大規模生產。目前有一些文獻和專利報道使用層析的方法純化rAAV，但是這些報道的技術主要存在如下兩個問題：1）層析技術作為超速離心的補充，整個工藝仍然含有超速離心步驟，難以放大；2）rAAV收獲液為細胞裂解液，意味著rAAV的收獲工藝較為復雜，需要包括裂解、離心、過濾等一系列單元操作。

如果從rAAV的培養上清中直接純化rAAV，將極大簡化rAAV的收獲工藝，只需要一步過濾操作即可。此外，工藝中不涉及超速離心等難以放大的單元操作，對大規模生產也具有重要的意義。

發明內容

為了解決以上技術問題，本發明提供了一種基于層析和膜過濾技術的、從病毒培養上清中直接純化腺相關病毒載體的工藝方法，包括以下幾個步驟：

步驟A：收集腺相關病毒載體的培養上清液，過濾去除細胞碎片，澄清后的樣品用于層析純化；

步驟B：通過陽離子柱對腺相關病毒載體進行捕獲和初步純化；

步驟C：通過吸附凝膠過濾柱進行中度純化；

步驟D：用陰離子交換柱進行精純；

步驟E：將收集的腺相關病毒載體進行超濾濃縮。

優選地，步驟A中選擇0.1-20 μm的逐級深層過濾器過濾，再經過0.22 μm或0.45 μm 濾器過濾，更優選地選擇0.22 μm濾器除菌過濾。

優選地，步驟B所選用的陽離子交換介質的配基為Sulphopropyl (SP)的強陽離子交換基團，例如SP Sepharose XL、SP Sepharose FF、Capto SP和Capto SP ImpRes等。

優選地，步驟B中的樣品處理前需要用水至少稀釋一倍，電導調至5-10 mS/cm，pH調至5-7，更優選地，pH調至5.5-6.2。

優選地，步驟B中的上樣體積為不超過30倍層析柱體積。

優選地，步驟B中的平衡緩沖液為50-100 mM 氯化鈉溶液，pH5.5-6.2。

優選地，步驟B中的洗脫緩沖液為20 mM Tris, 50-400 mM 氯化鈉溶液，pH6.0-9.0。

優選地，步驟B的操作過程為，先用平衡緩沖液沖洗層析柱直至電導和紫外吸收基線穩定；然后將樣品流經層析柱；再用平衡緩沖液沖洗層析柱直至電導和紫外吸收基線穩定；最后用洗脫緩沖液洗脫層析柱，監測紫外吸收值，出峰后收集樣品，收集2個柱體積。

優選地，步驟C所選用的吸附凝膠過濾介質為Capto Core 700。

優選地，步驟C中的平衡緩沖液為20 mM Tris, 50-400 mM 氯化鈉溶液，pH6.0-9.0。

優選地，步驟C的操作過程為，先用平衡緩沖液沖洗層析柱直至電導和紫外吸收基線穩定；然后將步驟B中收集的樣品流經層析柱，監測紫外吸收值，出峰后開始收集流穿液；再用平衡緩沖液沖洗層析柱直至電導和紫外吸收基線穩定，停止收集樣品；最后用0.5 M 氫氧化鈉和27%異丙醇溶液處理層析柱。

優選地，步驟C中收集的樣品用水調節至電導5-10 mS/cm。

優選地，步驟D所選用的陰離子交換介質的配基為Quaternary ammonium (Q)的強陰離子交換基團，例如Q Sepharose XL、Q Sepharose FF、Capto Q、Capto Q ImpRes、Source 30Q、Source 15Q等。

優選地，步驟D中的平衡緩沖液為20 mM Tris, 50-100 mM 氯化鈉溶液，pH7.0-9.0。

優選地，步驟D中的洗脫緩沖液為20 mM Tris, 0.5-1.0 M 氯化鈉溶液，pH7.0-9.0。