[發(fā)明專利]靶向血紅蛋白HBB突變基因的造血干細(xì)胞基因修飾方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710969302.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-18
• 公開（公告）號(hào): CN107746859B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃昕華;徐峰波;龐勇;劉倩;李德柱;唐正曉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 銀豐生物工程集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N15/864;C12N5/10
• 代理公司: 山東舜天律師事務(wù)所 37226
• 代理人: 李新海

本發(fā)明公開了一種靶向血紅蛋白HBB突變基因的造血干細(xì)胞基因修飾方法，方法一：gRNA1、gRNA2和spCas9?2.0的mRNA電轉(zhuǎn)進(jìn)入含血紅蛋白HBB突變基因的CD34+細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)1天后，以rAAV?HBB轉(zhuǎn)染CD34+細(xì)胞，收獲細(xì)胞；方法二：Cas9蛋白與gRNA1、gRNA2混合重組，電轉(zhuǎn)進(jìn)入CD34+細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)1天后，以rAAV?HBB轉(zhuǎn)染CD34+細(xì)胞，收獲細(xì)胞。本發(fā)明以中國(guó)廣東廣西最常見的HBB突變中CD41/42(?CTTT)為靶，基因編輯完成后，不在染色體上留下任何其他突變或插入序列，基因編輯效率可達(dá)15％～20％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及靶向血紅蛋白HBB突變基因的造血干細(xì)胞基因修飾方法，屬于新型的基因編輯糾正遺傳突變領(lǐng)域。

背景技術(shù)

地中海貧血(Thalassemia)于1925年由Cooley和Lee首先描述了這種發(fā)生在意大利兒童的嚴(yán)重貧血，由于最早發(fā)現(xiàn)于地中海區(qū)域，故稱為地中海貧血或海洋性貧血(簡(jiǎn)稱地貧)，據(jù)全國(guó)醫(yī)學(xué)名詞審定委員會(huì)規(guī)定應(yīng)稱為“珠蛋白生成障礙貧血”。地中海貧血是由于一種或多種珠蛋白肽鏈合成受阻或完全抑制，使血液中血紅蛋白成分組成異常，導(dǎo)致的一種慢性遺傳性溶血性貧血。地中海貧血是一種常見的常染色體隱性遺傳病，是世界上最常見和發(fā)病率最高的遺傳性溶血性貧血，也是危害最嚴(yán)重的血紅蛋白病之一。其中研究比較透徹的一種是鐮刀型細(xì)胞貧血病，病人的大部分紅細(xì)胞呈鐮刀狀，其特點(diǎn)是病人的血紅蛋白β—亞基N端的第六個(gè)氨基酸殘基是纈氨酸(val)，而不是正常的谷氨酸殘基(Glu)。但在中國(guó)廣東廣西最常見的是HBB突變中CD41/42(-CTTT)。

據(jù)WHO估計(jì)，每年出生的各類重型地中海貧血患兒數(shù)至少有20萬(wàn)。目前尚無(wú)治療地中海貧血的有效方法，而且醫(yī)療費(fèi)用昂貴，患者和家庭承受著巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和精神痛苦。

20世紀(jì)80年代曾溢滔院士主持開展了我國(guó)20省市自治區(qū)近60萬(wàn)人口的地中海貧血病的調(diào)查工作。根據(jù)12省地中海貧血的流調(diào)結(jié)果，該病主要分布在我圍長(zhǎng)江沿岸及以南的地區(qū)，包括11個(gè)省區(qū)以及陜西、甘肅、新疆等地。按當(dāng)時(shí)的調(diào)查結(jié)果，該病的檢出率為3.62％，其中α和β地中海貧血的檢出率分別為2.95％及0.67％。近30年來(lái)未再開展全國(guó)范圍內(nèi)地中海貧血癥的調(diào)查工作，只有廣東、廣西、云南等省開展區(qū)域性的調(diào)查工作。我國(guó)南方地區(qū)各地報(bào)道的地中海貧血基因缺陷率為2.5％～20％，而廣東及廣西兩省地中海貧血基因缺陷發(fā)生率分別高達(dá)10％及20％，兩省地中海貧血的病例占全國(guó)總數(shù)的2/5以上。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)地中海貧血治療分類(1)主要方法：規(guī)范性長(zhǎng)期輸血和去鐵治療；(2)根治方法：HLA相合的造血干細(xì)胞移植；(3)姑息方法：脾切除術(shù)或脾動(dòng)脈栓塞術(shù)等。輕型地中海貧血一般不需治療。

近年來(lái)，由于基因工程技術(shù)的突飛猛進(jìn)，CRISPR/Cas技術(shù)儼然已經(jīng)成為科學(xué)界的熱點(diǎn)之一，被廣泛應(yīng)用于各類體內(nèi)和體外的遺傳學(xué)改造、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模式動(dòng)物，以及基因治療等領(lǐng)域。2013年Science上連載了兩篇具有重要意義的CRISPR技術(shù)論文，麻省理工學(xué)院Zhang Feng的研究組，II型原核CRISPR適應(yīng)性免疫系統(tǒng)已顯示促進(jìn)RNA指導(dǎo)的位點(diǎn)特異性DNA切割。研究人員設(shè)計(jì)兩個(gè)不同的II型CRISPR系統(tǒng)，并證明Cas9核酸酶可以通過(guò)短RNAs誘導(dǎo)精確切割在人類和小鼠細(xì)胞內(nèi)源基因組基因位點(diǎn)。Cas9也可以轉(zhuǎn)化為切口酶促進(jìn)具有最小誘變活性的同源定向修復(fù)。最后，可以將多個(gè)引導(dǎo)序列編碼到單個(gè)CRISPR陣列中，以使得能夠同時(shí)編輯哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)，展示CRISPR技術(shù)的容易操作的可編程性和廣泛的適用性。Church的研究組首次使用CRISPR技術(shù)完成了RNA介導(dǎo)的人類基因組編輯。他們使用基因工程方法修改細(xì)菌的II類CRISPR系統(tǒng)，并比較了這種新系統(tǒng)與傳統(tǒng)TALEN方法在基因組編輯方面的效率差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種方式比TALEN有更快的時(shí)效性。僅這一年內(nèi)，CRISPR/Cas領(lǐng)域就取得了如此多鼓舞人心的突破，為其在基因治療等多領(lǐng)域發(fā)展奠定基礎(chǔ)。