[發(fā)明專(zhuān)利]靶向血紅蛋白HBB突變基因的造血干細(xì)胞基因修飾方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710969302.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107746859B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃昕華;徐峰波;龐勇;劉倩;李德柱;唐正曉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 銀豐生物工程集團(tuán)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/90
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/90;C12N15/864;C12N5/10
• 代理公司: 山東舜天律師事務(wù)所 37226
• 代理人: 李新海

1.一種靶向血紅蛋白HBB突變基因的造血干細(xì)胞基因修飾方法，其特征在于：為以下方法之一：

方法一：gRNA1、gRNA2和spCas9-2.0的mRNA電轉(zhuǎn)進(jìn)入含血紅蛋白HBB突變基因的CD34+細(xì)胞；細(xì)胞以StemSpan基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)1天后，以rAAV-HBB轉(zhuǎn)染CD34+細(xì)胞，細(xì)胞以添加有生長(zhǎng)因子的Stemspan培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2天計(jì)數(shù)和添加培養(yǎng)基維持CD34+細(xì)胞濃度在1×10⁶cells/ml；10天后，收獲細(xì)胞；

方法二：Cas9蛋白與gRNA1、gRNA2混合重組形成功能性的核苷酸蛋白復(fù)合物，電轉(zhuǎn)進(jìn)入CD34+細(xì)胞；細(xì)胞以StemSpan基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)1天后，以rAAV-HBB轉(zhuǎn)染CD34+細(xì)胞，細(xì)胞以添加有生長(zhǎng)因子的Stemspan培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2天計(jì)數(shù)和添加培養(yǎng)基維持CD34+細(xì)胞濃度在1×10⁶cells/ml；10天后，收獲細(xì)胞；

所述gRNA1和gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、2所示；

所述rAAV-HBB，是由rAAV和HDR450bp組成的，HDR450bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述spCas9-2.0的mRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述含血紅蛋白HBB突變基因的CD34+細(xì)胞，通過(guò)以下方法獲得：取HBB突變地貧患者的臍帶血100ml或骨髓50～100ml，經(jīng)過(guò)Ficoll分離單個(gè)核細(xì)胞后，以CD34磁珠獲取CD34+細(xì)胞，重懸在培養(yǎng)基中；

所述電轉(zhuǎn)條件為：電轉(zhuǎn)在4mm cuvette中，550V/cm,38ms；

所述添加有生長(zhǎng)因子的Stemspan培養(yǎng)基，是在Stemspan基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加TPO 、IL6、SCF、Flt3以及SR1得到的，TPO 、IL6、SCF、Flt3的終濃度均為100ng/ml，SR1的終濃度為1.0uM；

所述Cas9蛋白，是通過(guò)以下方法制備得到的：在ecoli表達(dá)質(zhì)粒中，克隆cas9 cDNA到GST-7xHis-TEV site的下游，經(jīng)過(guò)表達(dá)和純化，經(jīng)過(guò)TEV蛋白酶切獲取高純度的Cas9蛋白。

所述混合重組的條件為：50mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，37℃，60min。