[發明專利]一種胎盤樣硫酸軟骨素A或其衍生物的親和層析純化方法

有效

• 申請號: 201710966913.2
• 申請日: 2017-10-17
• 公開（公告）號: CN108570118B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 張居作;范秀軍;張鍵;程國鋼;陳指龍;張保珍;肖仲琳;韓金雨
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C08B37/08
• 分類號: C08B37/08
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

本發明涉及一種胎盤樣硫酸軟骨素A或其衍生物的親和層析純化方法，具體公開了一種胎盤樣硫酸軟骨素A或其衍生物的純化方法，所述純化方法為以親和層析的方法對胎盤樣硫酸軟骨素A或其衍生物進行層析純化，其中親和層析柱材為重組瘧原蟲感染紅細胞表面抗原蛋白與親和層析基質的偶聯物，所述層析純化的方法為將胎盤樣硫酸軟骨素A或其衍生物粗品上樣于親和層析柱上，并以洗滌液進行洗滌至沒有雜質流出，再以洗脫液進行洗脫并收集胎盤樣硫酸軟骨素A或其衍生物純品。本發明的純化方法能夠克服多糖純化的困難，分子大小和結構相近的其他多糖不被rVAR2吸附，容易被洗滌去除，獲得高純度的pl?CSA；而洗滌液條件pl?CSA被rVAR2配基牢固結合，洗脫液條件容易釋放，獲得了較高的回收率。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種胎盤樣硫酸軟骨素A或其衍生物的親和層析純化方法。

背景技術

親和層析的原理是利用生物分子間親和力的特異性和可逆性，偶聯親和配基于固定相吸附介質，流動相中的目標物通過固定相時被親和吸附，而流動相中的雜質被洗出，最后通過改變流動相條件，如pH值或者離子濃度和種類，解離配基與目標物之間的親和吸附，使目標物釋放進入流動相，從而獲得高純度目標物，自親和層析技術出現至今，這一項技術發展非常迅速，在生物技術領域取得了矚目的成績，現已經被廣泛用于蛋白質、肽類、酶制劑、抗原抗體、激素、核酸等。親和層析柱中被固定的配基選擇是親和純化的關鍵因素，根據配基與生物大分子之間相互作用體系的不同，可分為四種不同的類型，包括：1.生物親和層析，這種方法是利用特異性相互作用的配對物質來純化其中的一種物質，典型的配對物質包括酶-底物、酶-抑制劑、激素-受體等；2.免疫親和層析，這種方法是利用抗原抗體的特異性結合特性，以其中一方為配基吸附另一方，這種方法能獲得高純化倍數的物質，且能保持高的天然活性；3.金屬離子親和層析，這種方法是利用金屬離子能與某種蛋白形成螯合物，以固定化的金屬離子為配基，如利用組氨酸咪唑基團能與鎳離子特異性結合來純化具有組氨酸標簽的融合蛋白；4.擬生物素親和層析，這種方法是利用部分分子間或者分子內部的相互作用力，以人工合成固化的一種分子或者分子的一部分為配基，來純化目的蛋白。但是目前還鮮有多糖親和純化方法的建立和應用，關鍵的難點在于發現能夠與多糖特異性親和結合的配體。

多糖的提取方案通常采用醇提取、水提取、或者有機溶劑提取等方法分離總的多糖或者其中某一類性質的多糖，如利用Sevag液(V_氯仿:V_正丁醇＝4:1)加入含多糖的樣品中，劇烈振搖5min后4000rpm離心10min，利用蛋白質與氯仿和正丁醇相互作用形成凝膠不溶物，而多糖溶解在水相，多次反復操作，以達到去除蛋白等雜質，但此種方法所獲得的多糖為粗品，含有多種多糖組分，后續的研究、開發和應用等方面的質量不可控，多糖種類不可控，很難區分不同多糖間的性質、作用類型和作用方式，如肝素中的其他多糖的殘存嚴重阻礙了其臨床應用。為了從粗多糖中純化出某一種單體，比較成熟的方法是利用分子篩層析柱，如DEAE-纖維素-52層析柱、Sephadex G-100層析柱和AB樹脂等，這種方法已經廣發應用多糖的純化，如板藍根多糖純化、肝素純化、螺旋藻多糖純化等，這種方法在沒有更好的方法出現之前具有廣泛的優越性，但其缺陷在于純度還是較低，回收率低，為了提高純度，往往要犧牲超過50％的回收率，而對于分子大小和結構相近的物質更是無計可施。

發明內容

本發明利用細胞表面多糖被配基特異性識別的原理，既滋養層細胞表面的胎盤樣硫酸軟骨素A(pl-CSA)能被瘧原蟲感染紅細胞表面抗原VAR2CSA特異性的識別結合，以重組合成的VAR2CSA(rVAR2)，既pl-CSA最小結合部分為配基，通過與NHS活化的瓊脂糖偶聯制備親和層析柱材，建立pl-CSA親和層析純化方法，這一方法能夠克服多糖純化的困難(回收率低、純度低)，包括分子大小和結構相近的其他多糖不被rVAR2吸附，很容易被洗滌去除，獲得高純度的pl-CSA；而在洗滌液條件，pl-CSA被rVAR2配基牢固結合，洗脫液條件容易釋放，從而獲得了較高的回收率。