[發明專利]一種飲用水中復合污染物生物遺傳毒性快速、高通量檢測的方法

在審

• 申請號: 201710966593.0
• 申請日: 2017-10-17
• 公開（公告）號: CN107764965A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 李紅巖;李羅英;于志勇;李潔;鄭蓓
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: G01N33/18
• 分類號: G01N33/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種飲用水中復合污染物生物遺傳毒性快速、高通量檢測的方法，屬于環境檢測和評價技術范疇。

背景技術

飲用水是人類的必需品，水質直接影響人體健康。目前世界上已經合成或已鑒定的化學物質有1300多萬種，常見的或在用的有8萬種之多。其中具有致癌性的物質，如多環芳烴(苯并芘、煤焦油等)、芳香胺類等多種化學污染物及亞硝胺、亞硝酰胺等消毒副產物等，在飲用水中含量極低并且以混合物狀態存在。基于化學儀器的單一指標的檢測具有局限性，不能直接反應對生物的遺傳毒性效應。因此，飲用水中復合污染物生物毒性效應的測定在水質健康風險評估中至關重要。

目前，致突變試驗已被ISO和德日等國家列入標準的檢測方法的有Ames試驗和umu測試。Ames試驗使用菌株多，試驗操作繁雜，操作要求嚴格無菌，同時會受組氨酸干擾，出現疑似陽性結果。在對水樣進行遺傳毒性檢測時，對水樣量需求量高，造成水質管理成本加大。檢測結果方面也無法定性和定量的描述。

相比較之下，傳統的umu測試方法所用水樣量少，不需要嚴格滅菌條件，可用吸光度測定分析，操作簡單，易定量，具有很高的應用可行性。目前，該方法已經廣泛用于檢測水體、土壤、大氣顆粒物等樣品的遺傳毒性。

但是傳統的umu測試方法仍存在不足。傳統方法的菌株-80℃超低溫保存條件，很多行業無法達到這種要求，極大的限制了方法的應用和推廣；傳統方法需要對菌株進行復蘇和前培養過程，所需接近20小時，延長了測試時間；國際標準中ISO13829中規定的對菌株細胞破壁過程采用試劑體積大，種類多，容易造成實驗誤差；國際標準中規定的方法中ONPG溶液作為酶促反應底物，檢測結果顯示細胞對毒性物質的陽性響應值低，降低了實驗數據的準確性；另外，應急水質監測時，傳統方法耗時耗力，無法應對大量樣品的毒性高通量測試。因此，開發一種飲用水中復合污染物生物遺傳毒性快速、高通量檢測的方法十分必要。

發明內容

本發明的目的就是為了克服菌株-80℃超低溫保存難以廣泛推廣以及傳統SOS/umu測試法測試周期長、實驗試劑需求量大、實驗誤差大、難以應對大批量的樣品等不足，建立一種飲用水中復合污染物生物遺傳毒性快速、高通量的測試方法，研究-20℃低溫保存菌株可行性，優化實驗試劑和條件，縮短毒性暴露時間，限于8小時內完成全過程檢測。該發明是一種靈敏度高、快速、批量性、規范化檢測水樣的方法，能夠高通量檢測樣品生物遺傳毒性。

本發明解決上述問題的技術方案如下：飲用水中復合污染物生物遺傳毒性高通量檢測的方法，包括以下步驟：

取40μL貯存于-20℃條件的S.typhimuriumTA1535/pSK1002菌株于4mL TGA培養基中，于37℃培養3h，進行菌株活化。吸取98μL活化后的菌株至96微孔板中，將一系列濃度梯度的4-NQO標準溶液依次加入2μL，進行毒物暴露。微孔板須于37℃，1000rpm下進行培養3h。于波長570nm下，測定A595。培養結束后，加入4mg·mL^-1CPRG溶液，進行酶促反應。反應30min后，中止反應，測定A570。通過計算β-半乳糖苷酶的活性大小(RGA)，即分別計算飲用水中毒性物質和標準毒物4-NQO的誘導比率(IR)即根據環境樣品的IR值與4-NQO的IR進行比較，得出環境樣品的4-NQO的等當量濃度(TEQ_4-NQO)：

根據成年人的體重70kg和每日飲用水量為2L計算，飲用水中復合污染物生物遺傳毒性致癌風險評價方法為：

注：P值大于10^-6，無致癌風險；P值處于10^-6～10^-4之間，需對水樣進行控制；P值低于10^-4時，有致癌風險。

本發明的有益效果是：利用鼠傷寒沙門菌S.typhimurium TA1535中導入了攜帶umuC-Lac Z融合基因的啟動子及四環素和氯霉素耐藥基因，實現-20℃條件下兩個月內穩定保存菌株，有利于各行業推廣使用。使用該菌株作為毒物的受體，優化現有的馴化、后培養細菌的方法，縮短菌株培養時間和毒性檢測時間。同時通過微孔板法代替試管法，將限定實驗在8小時之內，實驗流程簡化，測試時間縮短，靈敏度高，準確性好。同時，優化試劑使用和實驗其他測試條件，節約成本，提高工作效率，能夠批量進行檢測水樣，特別是用于飲用水、水源水、尤其是突發應急狀態的水質的檢測，快速準確反映水質的狀態，是一套快速、準確度高、高通量的生物遺傳毒性測試方法。