[發(fā)明專利]非病毒類載體投遞MicroRNA與骨粉的復(fù)合材料及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710964926.6
• 申請(qǐng)日: 2017-10-17
• 公開（公告）號(hào): CN109663149A
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙瑾;李學(xué)平;原續(xù)波;侯信;戰(zhàn)琦;李思迪;韓冬琳;李雪;孫曉雷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): A61L27/36
• 分類號(hào): A61L27/36;A61L27/00;A61L27/56;A61L27/54;A61L27/50;A61P19/08;A61K31/7105
• 代理公司: 天津創(chuàng)智天誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 12214
• 代理人: 王秀奎

本發(fā)明提供非病毒類載體投遞MicroRNA與骨粉的復(fù)合材料及其制備方法，非病毒載體帶正電，MicroRNA帶負(fù)電，MicroRNA與非病毒載體以靜電作用的方式相結(jié)合，通過(guò)混合靜置的方式形成MicroRNA非病毒載體復(fù)合體，MicroRNA非病毒載體復(fù)合體再與骨粉進(jìn)行混合，得到非病毒類載體投遞MicroRNA與骨粉的復(fù)合材料。本發(fā)明的有益效果是填補(bǔ)了臨床上單獨(dú)使用骨粉帶來(lái)的缺陷，賦予骨粉骨生成性和誘導(dǎo)性，既可提高牙槽骨的成骨質(zhì)量，又可縮短成骨時(shí)間。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)用組織工程材料技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)涉及一種基于非病毒類載體投遞microRNA并摻雜已經(jīng)商用的骨粉促進(jìn)牙槽骨快速愈合的方法。

背景技術(shù)

針對(duì)牙列缺失或缺損，目前醫(yī)學(xué)上多采用可摘義齒、烤瓷牙技術(shù)或牙齒種植術(shù)對(duì)牙列進(jìn)行填補(bǔ)修復(fù)。可摘義齒適用范圍廣，便于自行摘戴，且費(fèi)用相對(duì)較低，但穩(wěn)定性較差，長(zhǎng)期使用可能會(huì)造成基牙損傷，引發(fā)一系列口腔疾病；烤瓷牙美觀堅(jiān)固、耐磨抗折且生物相容性較好，但因其以鄰近齒為受力依托，長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)造成周邊牙齒松動(dòng)，故而口腔種植技術(shù)逐漸受到人們關(guān)注。但是有很大一部分患者因?yàn)檠啦酃枪橇坎蛔愣荒芗皶r(shí)甚至無(wú)法進(jìn)行口腔種植。

目前，臨床上解決骨量不足的治療手段主要有自體骨、同種異體骨、異種骨、人工骨替代材料或組織工程骨植入等。其中，自體骨移植作為傳統(tǒng)的治療手段，最大優(yōu)勢(shì)即不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，但因供體骨量有限，大量取材較為困難，且易造成二次創(chuàng)傷，高吸收、并發(fā)癥較多。同種異體骨和異種骨移植手段我們需解決外源性抗原問(wèn)題，盡量避免免疫排斥反應(yīng)，降低二次疾病的風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)查閱，骨粉有著與人體骨相似的鈣磷比例，具有較為適宜的孔連接內(nèi)徑，有利于細(xì)胞的滲透與營(yíng)養(yǎng)物的循環(huán)。因其具有的較高孔隙率和相互連通性，可促進(jìn)位于腔隙中成骨細(xì)胞之間的胞間通訊，故而被視為骨傳導(dǎo)的良好材料。但是骨粉作為無(wú)機(jī)支架材料，缺乏誘導(dǎo)成骨的活性因子，所以骨粉雖然具有優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性但沒有骨誘導(dǎo)和骨生成性。

MicroRNA又稱微小RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，通過(guò)堿基配對(duì)方式結(jié)合到靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，可以抑制其翻譯，但不影響其轉(zhuǎn)錄。大量研究證實(shí)，miRNA在干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和骨形成中扮演著重要的角色。但是MicroRNA在體內(nèi)容易被酶降解，且本身含有磷酸根基團(tuán)帶負(fù)電性而不能主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而難以發(fā)揮誘導(dǎo)成骨的作用。為使目的基因發(fā)揮其最大效用，我們需要選擇合適的載體來(lái)進(jìn)行投遞。骨組織工程常用載體有兩種：病毒載體及非病毒載體。

非病毒載體包括脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物、無(wú)機(jī)納米粒子投遞系統(tǒng)等。投遞microRNA的載體進(jìn)入機(jī)體后，首先要通過(guò)排列較為致密的細(xì)胞外基質(zhì)及各種纖維蛋白，該過(guò)程往往會(huì)阻礙載體向細(xì)胞內(nèi)的遞送，致使效率降低；到達(dá)靶細(xì)胞后，細(xì)胞以內(nèi)吞的方式將非病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)部，該過(guò)程需保持遞送載體的活性，同時(shí)使其在胞內(nèi)進(jìn)行降解。非病毒載體安全性高，可設(shè)計(jì)性及可操作性強(qiáng)，對(duì)其進(jìn)行修飾改造較易滿足以上要求。脂質(zhì)體是一種類脂類雙分子層的球狀囊泡結(jié)構(gòu)，以脂類為主要成分，具有一定的生物可降解性及較好的生物相容性。脂質(zhì)體用作基因載體有著二十余年的歷史，最早使用脂質(zhì)體遞送RNA的是Felgner等人。他們開發(fā)了一種較為有效的RNA轉(zhuǎn)染方法，使用合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)——DOTMA與脂質(zhì)體相混合，將帶有熒光素酶的mRNA在體外轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH 3T3小鼠細(xì)胞中，觀察熒光素酶在細(xì)胞中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了該種方法可將RNA有效的轉(zhuǎn)染進(jìn)生物細(xì)胞中，且組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明基因在細(xì)胞中得到了較好的表達(dá)，轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH 3T3小鼠細(xì)胞后，加蓋B8-球蛋白非翻譯序列產(chǎn)生了多于對(duì)照組至少1000倍的熒光蛋白。無(wú)機(jī)納米粒子投遞系統(tǒng)包括金納米粒子、介孔硅納米粒子等。金納米粒子具有生物惰性，毒性較低，易于進(jìn)行修飾、合成和功能化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種非病毒類載體投遞MicroRNA與骨粉的復(fù)合材料及其制備方法，以骨粉作為支架材料，保持了多孔的天然骨無(wú)機(jī)結(jié)構(gòu)，有著與人牙槽骨相似的物化結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，且生物相容性較好，引入脂質(zhì)體等非病毒載體包載的microRNA，將活性因子引入支架材料中，發(fā)揮骨誘導(dǎo)的作用，以填補(bǔ)單獨(dú)使用骨粉帶來(lái)的缺陷。