[發明專利]一種16種真菌毒素的檢測方法

在審

• 申請號: 201710962968.6
• 申請日: 2017-10-17
• 公開（公告）號: CN107741462A
• 公開（公告）日: 2018-02-27
• 發明（設計）人: 符金華;楊琳芬;董澤民;徐國茂;邢磊;姜文娟;尹騰桂;李勇;李俊;金海紅;李瑾瑾;王亮;鄧宇
• 申請（專利權）人: 江西省獸藥飼料監察所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/86;G01N30/16
• 代理公司: 江西省專利事務所36100
• 代理人: 胡里程

技術領域

本發明涉及一種檢測方法，尤其是一種飼料中黃曲霉毒素等16種真菌毒素的測定，液相色譜-串聯質譜法，屬于飼料及飼料原料檢測領域。

背景技術

真菌毒素是真菌在適宜條件下產生的有毒次級代謝產物，能夠引發人類、動物各種急、慢性疾病。主要威脅人類健康的真菌毒素種類有單端孢霉烯族類毒素、伏馬類毒素、赭曲霉類毒素、黃曲霉類毒素等。目前，大部分的國家和地區都制定了嚴格的真菌毒素限量標準，我國也高度重視霉菌毒素污染問題，在2015年新修訂的《食品安全法》中，首次將生物毒素明確列入重點關注的污染物質中。我國也已經制定了嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素(OTA)四種真菌毒素限量標準，新的毒素限量也在逐步制定完善中。由于異常氣候和病蟲害等原因，近年來糧食真菌毒素污染多發易發，危害嚴重損失巨大。據報道，我國每年有3100萬噸飼料及飼料原料在生產、儲存、運輸過程中被真菌污染，約占飼料及飼料原料年總產量的6.2％。為了保證我國飼料及飼料原料質量安全，避免不必要的經濟損失，及時快速監測調查真菌毒素污染種類、水平及其風險尤為重要。

由于真菌毒素種類多樣，且存在協同污染，為確保全面、快速的了解糧食中真菌毒素的污染情況，迫切需要一種簡單、快速、靈敏、同時準確測定飼料及飼料原料中多種真菌毒素的方法。目前真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法、酶聯免疫吸附法、高效液相色譜法、液相色譜串聯質譜法。薄層色譜法程序復雜、可重復性和再現性差、基于抗原抗體相互作用的酶聯免疫吸附法雖有較高的選擇性，但無法準確定量，且易受基質干擾，產生假陽性。高效液相色譜法和液相色譜串聯質譜法主要使用固相萃取小柱、Mcosep凈化柱或者免疫親和柱對樣品進行凈化，雖然能夠去除提取液中的色素、脂類、蛋白等雜質，降低基質對毒素離子化效率的影響，但是凈化過程繁雜耗時，凈化成本高，對操作人員要求高，且由于真菌毒素的化學性質不同、極性范圍廣，會造成某些真菌毒素的損失，影響定量結果的準確性。

隨著液相色譜-質譜的升級改進，儀器靈敏度大幅提高，可通過樣品直接稀釋進樣方式進行檢測，有效避免了凈化過程中目標物的損失，減少對凈化材料的依賴，降低檢測成本，提高樣品前處理效率，實現多組分快速同時檢測。但是液相色譜-質譜法的離子化過程易受基質干擾會產生基質效應，影響毒素的精確定量。全碳標記的穩定同位素內標與目標毒素分子量不同，但結構、化學性質完全相同，色譜保留時間也與目標毒素相同，同時又不存在于自然界。因此使用全碳標記的穩定同位素內標定量能夠有效的補償每個真菌毒素的基質效應，保證液質分析結果的準確性和穩定性。本方法的研究有助于提高飼料及飼料原料樣品檢測、監測效率，降低成本，保護環境，保障從業人員健康安全。本方法對后續標準制定，以及飼料及飼料原料污染黃曲霉毒素的相關科研、標準制定起到較好的指導、參考、促進作用。

因此，研究開發一種飼料中黃曲霉毒素等16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯質譜法，對于發展綠色畜牧業、保證人類的身體健康，促進養殖業健康可持續發展，具有重要的現實意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種16種真菌毒素的檢測方法，該方法能簡便、快速、準確地同時定性定量檢測飼料及飼料原料中16種真菌毒素，提高飼料及飼料原料樣品檢測、監測效率，降低成本，保護環境，保障從業人員健康安全。

本發明的技術方案為：一種16種真菌毒素的檢測方法，其步驟：(1)提取：準確稱取精確到0.01g的樣品5g于50mL離心管中，加入20mL乙腈-水-乙酸混合液的提取液，混合液三種液體體積比70:29:1，渦旋或振蕩提取30min，然后以6000r/min離心10min，吸取0.5mL上清液于1.5mL離心管中，加入0.5mL水并渦旋混勻，在4℃下以12000r/min離心10min，上清液過0.2μm的聚四氟乙烯濾膜，收集得樣品濾液A；(2)加入穩定同位素：分別準確吸取180uL濾液A和16種真菌毒素混合標準溶液于不同的400uL內插管中，加入20uL 14種真菌毒素穩定同位素混合工作液渦旋混勻后，得到含有14種真菌毒素穩定同位素內標的16種真菌毒素混合標準溶液和含有14種真菌毒素穩定同位素內標的樣品待測液；

16種真菌毒素混合標準溶液見表一；

14種真菌毒素穩定同位素混合工作液見表二；

表一16種真菌毒素混合標準溶液

表二14種真菌毒素穩定同位素混合工作液濃度