[發(fā)明專利]一種重組腈水合酶大腸桿菌基因工程菌的高密度發(fā)酵方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710962094.4
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107815446B
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊立榮;周海勝;張紅玉;吳堅平;徐剛
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種重組腈水合酶大腸桿菌基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，包括：菌種活化、種子培養(yǎng)和補料分批發(fā)酵，其特征在于，表達所述重組腈水合酶的基因工程菌為大腸桿菌E. coli BL21(DE3)；所述補料分批發(fā)酵的過程包括：

（1）細胞快繁階段：將種子培養(yǎng)后的重組腈水合酶基因工程菌菌種接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；其中，培養(yǎng)的溫度為32~35℃，發(fā)酵液的溶氧量為20~30%，發(fā)酵液的pH值為6.8~7.2；在培養(yǎng)過程中，通過向發(fā)酵液補加補料培養(yǎng)基來控制基因工程菌的比生長速率在0.2~0.5之間；以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的體積計，所述基因工程菌菌種的接種量為5~15%；發(fā)酵培養(yǎng)的時間為8~16 h；

（2）產(chǎn)酶階段：待發(fā)酵液中基因工程菌的細胞濃度達到OD₆₀₀=70~90時，向發(fā)酵液中加入乳糖誘導(dǎo)基因工程菌產(chǎn)酶，直至發(fā)酵結(jié)束；其中，培養(yǎng)的溫度為18~20℃，發(fā)酵液的溶氧量為30~50%，發(fā)酵液的pH值為6.8~7.2；在培養(yǎng)過程中，通過向發(fā)酵液補加補料培養(yǎng)基來控制基因工程菌的比生長速率在0.01~0.1之間；以發(fā)酵液的體積計，所述乳糖的投加量為5~15g/L；發(fā)酵培養(yǎng)的時間為48~96 h；

所述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為：20 g/L甘油，8 g/L蛋白胨，12 g/L酵母抽提物，17.1 g/LNa₂HPO₄·12 H₂O，3.0 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L NaCl，1.0 g/L NH₄Cl和0.6 g/L MgSO₄，卡那霉素濃度為50 μg/mL；所述補料培養(yǎng)基為：300~600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10 g/L酵母抽提物。

2.如權(quán)利要求1所述的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，步驟（1）中，控制所述基因工程菌的比生長速率為0.2~0.3；步驟（2）中，控制所述基因工程菌的比生長速率0.01~0.04。

3.如權(quán)利要求1所述的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，所述菌種活化的過程，包括：將基因工程菌菌株接種至固體培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)；

所述活化培養(yǎng)的溫度為35~37℃，時間為8~16h；所述固體培養(yǎng)基為LB-Kan固體培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，10 g/L氯化鈉，pH 7.0，20g/L瓊脂粉，卡那霉素濃度為50μg/mL。

4.如權(quán)利要求1所述的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)的過程，包括：將活化后的菌種接種至一級種子培養(yǎng)基中，進行一級培養(yǎng)；再接種至二級種子培養(yǎng)基中進行二級培養(yǎng)；所述一級培養(yǎng)的溫度為35~37℃，時間為8~24h；所述二級培養(yǎng)的溫度為35~37℃，時間為3~12h。

5.如權(quán)利要求4所述的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，所述一級種子培養(yǎng)基為LB-Kan培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，10 g/L氯化鈉， pH 7.0，卡那霉素濃度為50 μg/mL；

所述二級種子培養(yǎng)基為12 g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43 g/L K₂HPO₄·3 H₂O，2.31 g/L KH₂PO₄，5.04 g/L甘油，卡那霉素濃度為50 μg/mL。