[發(fā)明專利]一種重組腈水合酶大腸桿菌基因工程菌的高密度發(fā)酵方法

有效

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• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107815446B
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊立榮;周海勝;張紅玉;吳堅平;徐剛
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發(fā)明公開了一種重組腈水合酶大腸桿菌基因工程菌的高密度發(fā)酵工藝，該工藝采用補料分批發(fā)酵，過程包括：細胞快繁階段：將菌種接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基；溫度為30～37℃，溶氧量為5～75％，pH值為6.8～7.2；工程菌比生長速率為0.2～0.5；產(chǎn)酶階段：細胞濃度達到OD₆₀₀＝70～90時，加入乳糖誘導工程菌產(chǎn)酶，直至發(fā)酵結(jié)束；培養(yǎng)溫度為15～25℃，溶氧量為5～75％，pH值為6.8～7.2；工程菌比生長速率為0.01～0.1。本發(fā)明工藝將補料分批發(fā)酵人為分成兩個階段并控制各階段的培養(yǎng)條件，使得重組腈水合酶基因工程菌實現(xiàn)高密度發(fā)酵，不僅提高了產(chǎn)腈水合酶的工程菌的菌濃度，還提高了腈水合酶的酶活。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組腈水合酶大腸桿菌基因工程菌的高密度發(fā)酵方法。

背景技術(shù)

腈水合酶(EC 4.2.1.84)是一類廣泛存在于自然界的微生物酶(迄今已報道的腈水合酶幾乎全部來源于細菌)，催化腈化合物生成相應的酰胺，腈水合酶的發(fā)現(xiàn)和應用是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域中的經(jīng)典代表作之一，具有化學催化劑無法比擬的優(yōu)勢，從而被廣泛應用于酰胺化學品的合成中。腈水合酶最早被用于催化丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺，日本是生物法合成丙烯酰胺技術(shù)的最早實踐和擁有者，而且生產(chǎn)工藝技術(shù)也最為先進。歷經(jīng)三次菌種革新，由三代菌種R.rhodochrous J1，實現(xiàn)了生產(chǎn)丙烯酰胺的能力由4000噸/年提升到20000噸/年(Nagasawa T.Shimizu H.Yamada H.The superiority of the third-generationcatalyst,Rhodococcus rhodochrous J1nitrile hydratase,for industrialproduction of acrylamide[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.1993,40:189-195)。我國從上世紀80年開始進行微生物生產(chǎn)丙烯酰胺的研究，已取得了重大突破。上海農(nóng)藥研究所沈寅初院士課題組從泰山的土壤中發(fā)現(xiàn)了腈水合酶菌株Nocardia sp.86-163，和日本Rhodococcus Rhodochrous J1的產(chǎn)酶水平基本上處于同一高度(張云樺，方仁萍，沈寅初.一株產(chǎn)丙烯腈水合酶菌株的的研究[J].工業(yè)微生物，1998,28:1-5)(沈寅初，張國凡，韓建生.微生物生產(chǎn)丙烯酰胺[J].工業(yè)微生物，1994,24:24-32)。生物催化法生產(chǎn)煙酰胺是腈水合酶應用的另一大實例，瑞士龍沙(Lonza)集團已在我國廣州南沙市建立一條年產(chǎn)9000噸的煙酰胺生產(chǎn)線，采用R.Rhodochrous J1全細胞作為催化劑，應用細胞固定化技術(shù)進行生產(chǎn)。

目前，應用于工業(yè)化生產(chǎn)的腈水合酶都是通過野生菌來表達、用野生菌細胞進行發(fā)酵生產(chǎn)。但野生菌發(fā)酵周期長、產(chǎn)酶質(zhì)量不穩(wěn)定。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，采用分子克隆構(gòu)建腈水合酶基因工程菌，有望解決上述實際問題。重組異源蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)，除了需要構(gòu)建出高效穩(wěn)定表達外源基因產(chǎn)物的工程菌外，大規(guī)模培養(yǎng)工程菌的技術(shù)和工藝顯得日趨重要。因為，在工程菌的大規(guī)模發(fā)酵過程中，重組異源蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)量取決于外源基因的表達水平以及菌體密度。在外源基因表達水平不變的前提下，提高工程菌的發(fā)酵密度可以大幅度提高產(chǎn)量，降低成本。但目前，工業(yè)化應用的產(chǎn)腈水合酶的微生物都是經(jīng)過低密度發(fā)酵獲得的，一般菌體密度(以干重計)在10g/L以下，這導致生產(chǎn)腈水合酶的設(shè)備投資大、效率低下、成本高昂。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種全新的高密度發(fā)酵方法，特別適用于重組腈水合酶基因工程菌的大規(guī)模生產(chǎn)，該發(fā)酵方法可顯著提高基因工程菌的濃度和重組腈水合酶的酶活力。

具體技術(shù)方案如下：

一種重組腈水合酶大腸桿菌基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，包括：菌種活化、種子培養(yǎng)和補料分批發(fā)酵，其特征在于，所述補料分批發(fā)酵的過程包括：