[發(fā)明專利]一種皮膚成纖維前體細胞分離培養(yǎng)及制劑制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710961320.7
• 申請日: 2017-10-17
• 公開（公告）號: CN109666632A
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王振坤;朱軼;劉小龍
• 申請（專利權(quán)）人: 王振坤
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/078
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及細胞醫(yī)療美容領(lǐng)域，公開了一種成纖維前體細胞分離培養(yǎng)及制劑制備方法。本發(fā)明通過組織塊貼壁法從自體皮膚組織中獲得成纖維前體細胞，本發(fā)明進一步利用自體富血小板因子血漿對自體皮膚成纖維前體細胞擴增，獲得足量的自體皮膚成纖維前體細胞，皮膚成纖維細胞具有分泌膠原、透明質(zhì)酸等細胞外基質(zhì)的功能，對除皺、軟組織修復(fù)和面部年輕化具有良好的效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種皮膚成纖維前體細胞分離培養(yǎng)及制劑制備方法。本發(fā)明屬于皮膚成纖維前體細胞醫(yī)療美容領(lǐng)域。

背景技術(shù)

年輕的皮膚中存在著大量的成纖維細胞，能夠產(chǎn)生充足的膠原蛋白、透明質(zhì)酸、彈性纖維等物質(zhì)，很好的支撐了皮膚的結(jié)構(gòu)。然而，隨著年齡的增長，體內(nèi)各種成體干細胞逐步減少，皮膚內(nèi)的成纖維細胞開始不斷的流失，細胞新陳代謝能力減弱，相應(yīng)的其產(chǎn)生的膠原蛋白、彈性纖維、透明質(zhì)酸這些物質(zhì)就會減少，不足以支撐皮膚的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致真皮層變薄，皮膚開始松弛，出現(xiàn)皺紋。所以成纖維細胞的活力下降、數(shù)量減少，是造成皮膚衰老的根本原因。

自體成纖維前體細胞經(jīng)過分離、擴增，然后注射到皺紋和疤痕部位，這些細胞增加皮膚內(nèi)成纖維細胞的數(shù)量，增加自體的膠原蛋白產(chǎn)生，產(chǎn)生的這些膠原蛋白可將皺紋和疤痕填充從而達到消除皺紋和面部年輕化的目的。皮膚成纖維前體細胞提高皮膚的新陳代謝，改善微循環(huán)，激活皮膚細胞的分裂和增殖，促生皮膚功能細胞，加速膠原蛋白的合成，恢復(fù)細胞彈性，平復(fù)細紋。

皮膚成纖維前體細胞體外培養(yǎng)存在外源污染的風(fēng)險，如培養(yǎng)體系中牛源血清的使用可能引入牛源支原體、病毒等病原微生物污染的風(fēng)險，培養(yǎng)體系中豬源胰蛋白酶的使用可能引入豬源支原體、病毒等病原微生物污染的風(fēng)險。在培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量皮膚成纖維前體細胞的同時，應(yīng)保持細胞功能，避免引入外源病原體污染的風(fēng)險。通過貼壁法提取皮膚成纖維前體細胞，避免了膠原酶長時間的操作和外源膠原酶的引入；使用自體富血小板因子血漿及重組胰酶可規(guī)避以上污染風(fēng)險；自體富血小板因子血漿能夠有效對皮膚成纖維前體細胞擴增，且保持其分泌細胞外基質(zhì)的功能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的成纖維前體細胞數(shù)量、細胞活性、操作程序、應(yīng)用風(fēng)險等缺陷，提供一種簡單分離、高效擴增、高效分泌細胞外基質(zhì)、移植后存活效率高的皮膚成纖維前體細胞制劑方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明提出了一種皮膚成纖維前體細胞分離方法，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明提供一種皮膚成纖維前體細胞分離方法，包括以下步驟：

1)采集外周血，在生物安全柜內(nèi)轉(zhuǎn)移至離心管。700g離心10分鐘，吸取上層黃色血漿至潔凈離心管中，剩下的血液加入生理鹽水至原體積。

2)向離心管中加入密度為1.057的Percoll，再按緩慢加入上述生理鹽水稀釋的外周血，500g離心20分鐘。

3)吸取中上層血小板，至潔凈50ml離心管中，400g離心8分鐘。

4)上清轉(zhuǎn)移至潔凈50ml離心管，1600g離心5分鐘。

5)棄上清，取步驟1中的血漿重懸血小板沉淀。

6)將含有富血小板血漿的離心管置于液氮中30秒，然后于37℃水浴鍋解凍，如此重復(fù)操作3遍。

7)將凍融后的富血小板血漿2000g離心5分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至注射器中，用0.22um濾頭過濾，濾出液即為富血小板因子血漿，置于4℃冰箱待用。

8)耳后取皮，置于含青、鏈霉素雙抗的PBS浸泡30分鐘。

9)在生物安全柜內(nèi)，將皮膚組織置于無菌潔凈容器內(nèi)，用含青、鏈霉素雙抗的PBS沖洗。

10)用剪刀將皮膚組織剪成1mm³以內(nèi)的小塊，用鹽水重懸至50ml離心管，300g離心洗滌2遍。