[發明專利]一種皮膚成纖維前體細胞分離培養及制劑制備方法在審
| 申請號： | 201710961320.7 | 申請日： | 2017-10-17 |
| 公開（公告）號： | CN109666632A | 公開（公告）日： | 2019-04-23 |
| 發明（設計）人： | 王振坤;朱軼;劉小龍 | 申請（專利權）人： | 王振坤 |
| 主分類號： | C12N5/077 | 分類號： | C12N5/077;C12N5/078 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 150001 黑龍江省哈爾濱市*** | 國省代碼： | 黑龍江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 成纖維前體細胞 自體皮膚 分離培養 制劑制備 皮膚成纖維細胞 組織塊貼壁法 軟組織修復 細胞外基質 富血小板 美容領域 透明質酸 除皺 膠原 擴增 自體 足量 分泌 血漿 皮膚 細胞 醫療 | ||
1.一種皮膚成纖維前體細胞分離培養及制劑制備方法，其特征在于包括以下步驟：
1)血小板分離和富血小板因子血漿制備；
2)皮膚成纖維前體細胞的分離、培養；
3)皮膚成纖維前體細胞制劑制備。
2.根據權利要求1所述的血小板分離和富血小板因子血漿制備，其特征在于，用密度梯度離心法和差速離心法獲得血小板，用自體血漿重懸血小板后，經過3次反復凍融，2000g離心，上清夜過濾至潔凈容器中。
3.根據權利要求1所述的皮膚成纖維前體細胞的分離，其特征在于，取皮后，、鏈霉素雙抗浸泡皮膚組織30分鐘，用剪刀剪成1mm3以內的小塊，用500ul-1ml含富血小板因子血漿的培養基重懸、接種于T25培養瓶。
4.根據權利要求1所述的皮膚成纖維前體細胞的培養，其特征在于，待皮膚成纖維前體細胞生長融合至80％，皮膚組織繼續接種到新的T25培養瓶，細胞用胰酶消化后接種到T75培養瓶。
5.根據權利要求1所述的皮膚成纖維前體細胞制劑的制備，其特征在于，待多次擴增后的皮膚成纖維前體細胞生長融合至80％，用重組胰蛋白酶消化，待細胞縮小，用胰酶抑制劑終止消化，離心洗滌兩遍，將其與注射溶劑混合。
6.根據權利要求5所述的注射溶劑，包括但不限于生理鹽水、玻尿酸、自體血漿、富血小板因子血漿。
7.根據權利要求2所述的密度梯度離心法，其特征在于，分離液密度為1.037-1.077，優選的分離液密度為1.057，其原料包括但不限于聚蔗糖-泛影葡胺和聚乙烯吡咯烷酮硅膠。
8.根據權利要求2所述的密度梯度離心法和差速離心法，其特征在于，離心條件為400-800g/15-30分鐘/慢升慢降，優選的離心條件為500g/20分鐘/慢升慢降，吸取中上層血小板后加入生理鹽水，400g/8分鐘離心取上層液體，1600g/5分鐘離心棄上清。
9.根據權利要求2所述的凍融，其特征在于，置于液氮中30秒后迅速于37℃水浴鍋解凍。
10.根據權利要求3所述的含富血小板因子血漿的培養基，其特征在于，富血小板因子血漿使用濃度為1％-5％，優選的濃度為2.5％，培養基包括但不限于MEM、DMEM基礎培養基及各種無血清培養基。
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