[發(fā)明專利]一種微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710961022.8
• 申請日: 2017-10-17
• 公開（公告）號: CN107475442A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?jiān)旗o;李威;張中娜
• 申請（專利權(quán)）人: 生工生物工程（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11371
• 代理人: 劉書芝

1.一種結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，其包括：用引物對待檢樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

其中，所述引物包括針對待檢微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增的檢測引物和針對內(nèi)參微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增的內(nèi)參引物；

所述待檢微衛(wèi)星位點(diǎn)包括：BAT-25，BAT-26，D2S123，D5S346和D17S250；

所述檢測引物包括：SEQ ID NO.1-2所示的第一引物對、SEQ ID NO.3-4所示的第二引物對、SEQ ID NO.5-6所示的第三引物對、SEQ ID NO.7-8所示的第四引物對和SEQ ID NO.9-10所示的第五引物對；

所述內(nèi)參微衛(wèi)星位點(diǎn)為Penta C。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，所述內(nèi)參引物包括SEQ ID NO.11-12所示的第六引物對。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，所述第二引物對和第五引物對均標(biāo)記有第一熒光標(biāo)記；

所述第四引物對和第六物對均標(biāo)記有第二熒光標(biāo)記；

所述第一引物對和第三引物對均標(biāo)記有第三熒光標(biāo)記；

所述第一熒光標(biāo)記、所述第二熒光標(biāo)記和所述第三熒光標(biāo)記中的任意兩者不相同。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，所述第一熒光標(biāo)記選自如下熒光標(biāo)記中的任意一種：FAM、HEX、JOE、TAMRA、ROX和VIC；

所述第二熒光標(biāo)記選自如下熒光標(biāo)記中的任意一種：FAM、HEX、JOE、TAMRA、ROX和VIC；

所述第三熒光標(biāo)記選自如下熒光標(biāo)記中的任意一種：FAM、HEX、JOE、TAMRA、ROX和VIC。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，在所述第一引物對、所述第二引物對、所述第三引物對、所述第四引物對、所述第五引物對和所述第六引物對中，每個(gè)引物對的上游引物的5’端標(biāo)記有熒光標(biāo)記。

6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，在PCR擴(kuò)增的體系中，所述第一引物對的濃度為0.0125-0.05μM，所述第二引物對的濃度為0.05-0.2μM，所述第三引物對的濃度為0.1-0.4μM，所述第四引物對的濃度為0.1-0.4μM，所述第五引物對的濃度為0.1-0.4μM，所述第六引物對的濃度為0.025-0.1μM。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的條件為：94-96℃預(yù)變性3-5min；94-96℃變性25-45s；58-60℃退火60-120s，70-72℃延伸30-60s，29-32個(gè)循環(huán)；58-60℃延伸30-60min。

8.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的體系中還含有以下組分：Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、dNTP、MgCl₂以及甘油。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，在PCR擴(kuò)增的體系中，Tris-HCl的濃度為18-22mM、KCl濃度為18-22mM、(NH₄)₂SO₄的濃度為3-7mM、dNTP的濃度為0.1-0.5mM、MgCl₂的濃度為2-6mM、甘油的質(zhì)量百分比為1-2％。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的方法，其特征在于，所述方法還包括：將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳。