[發明專利]一種微球與抗體的定向偶聯方法及應用

有效

• 申請號: 201710960301.2
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107764992B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 曹林;唐波;牛英波;朱婷婷
• 申請（專利權）人: 南京諾唯贊醫療科技有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;杜靜

本發明公開了一種微球與抗體的定向偶聯方法，羧基微球與抗體F(ab’)片段以巰基偶聯的方式實現定向偶聯，形成抗體微球復合物。該方法能夠有效控制抗體與微球連接時的方向，實現定向偶聯從而提高膠乳增強免疫比濁試劑的靈敏度，并能提高試劑對于類風濕因子(RF)的抗干擾能力。

技術領域

本發明涉及醫學檢測領域，尤其涉及一種通過定向偶聯提高膠乳試劑靈敏度和特異性的方法和應用。

背景技術

膠乳增強免疫比濁法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是一種穩定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。PETIA法分為兩種，一種是散射比濁檢測法；另一種是透射比濁檢測法。這兩種方法的基本原理都是在高分子膠乳微球的表面交聯多克隆抗體或者單克隆抗體，當交聯有抗體的微球與抗原結合后，在短時間內會迅速聚集在一起，改變反應液的散光性能或透光性能。反應液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關性，在一定范圍內可以反映被測抗原的濃度。PETIA檢測方法是基于這一原理在均相反應體系中進行抗原抗體免疫反應從而測定待檢測體液蛋白的含量。此外，該方法使用全自動生化分析儀進行檢測，自動化程度高，排除了環境等因素的干擾，使得該方法相比于酶聯免疫吸附法、免疫層析法等方法學具有更好的測試穩定性、準確性，檢測通量高。

目前，PETIA檢測試劑所采用的微球粒徑分布從20nm～4μm，在微球與抗體之間增加的橋聯化學臂一定程度上降低了抗體與微球結合時的位阻效應，一方面提高了抗體的有效偶聯量，另一方面有效的保護了抗體的三維結構，有效保護了抗體的生物活性區域。檢測試劑的靈敏度因此得到了極大的改善，可以達到1.0ng/ml。雖然比ELISA等方法學的靈敏度要差一些，但是對于現有的許多體液蛋白在正常人體內的含量，已基本可以滿足臨床檢測要求。

然而隨著檢驗醫學的飛速發展，對于低濃度檢測物質的檢測越來越多，其檢測濃度已從μg/ml級別下降至ng/ml級別，甚至是更微量的pg/ml級別，這對于體外診斷試劑的靈敏度要求也越來越高。目前常用于提高膠乳增強免疫比濁試劑測試靈敏度的方法，包括使用更高親和力的抗體，使用粒徑更大且穩定性更好的微球等，但是對于這些方法的實現，開發難度大，且會在現有基礎上大幅度提高試劑的研發及生產成本，無法在膠乳免疫比濁試劑開發上實現普及應用。

在膠乳增強免疫比濁試劑制備過程中，抗體與微球的偶聯方法眾多，但是都存在一個問題，即抗體在連接到微球上的方向無法控制。眾所周知，抗體與抗原結合的區域位于抗體的F(ab)片段上，若在偶聯過程中，與微球相連的是抗體的F(ab)片段，那么向外伸展的就是與抗原沒有結合活性的Fc片段，這就導致這一偶聯抗體為無效抗體。而在抗體與微球進行偶聯過程中，抗體的連接方向存在很大的隨機性，無效連接抗體的存在使得抗體的利用率不高，并大大降低試劑最終的靈敏度。已經提出的方法有CN106501505A中提及的定向偶聯方法，但該方法仍有兩個缺點。一是本實驗室研究結果及梁延桂在其碩士學位論文中的研究結果表明，全長抗體還原后目的產物的得率很低。還原全長抗體的目的是打開位于Fc段的重鏈間的兩對二硫鍵，獲得一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵連接的抗體片段，并利用形成的自由巰基進行定向偶聯。但通過使用不同種類的還原劑、不同的還原時間以及不同的還原條件進行抗體還原方案的篩選，最終目的產物得率均不超過25％。二是該方法易造成類風濕因子(RF)的干擾，降低試劑的靈敏度和特異性。

發明內容

本發明的目的是提供一種微球與抗體的定向偶聯方法，該方法能夠有效控制抗體與微球連接時的方向，實現定向偶聯從而提高膠乳增強免疫比濁試劑的靈敏度與穩定性，并同時提高試劑對于類風濕因子(RF)的抗干擾能力及實現試劑對全血樣本的檢測。本發明的另一目的是提供該方法在PETIA方法學制備的體外診斷試劑盒中的應用。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案如下：

本發明提供一種微球與抗體的定向偶聯方法，羧基微球與抗體F(ab’)片段以巰基偶聯的方式實現定向偶聯，形成抗體微球復合物。