[發明專利]一種微球與抗體的定向偶聯方法及應用

有效

• 申請號: 201710960301.2
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107764992B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 曹林;唐波;牛英波;朱婷婷
• 申請（專利權）人: 南京諾唯贊醫療科技有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;杜靜

1.一種微球與抗體的定向偶聯方法，其特征在于，羧基微球加入活化劑，35～38℃活化孵育0.5～1小時，除去活化劑，然后與抗體F(ab’)片段以巰基偶聯的方式實現定向偶聯，形成抗體微球復合物；所述的活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺，且1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺的摩爾比是1:1～1:10。

2.根據權利要求1所述的定向偶聯方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)全長抗體通過蛋白酶切反應制備得到抗體的F(ab’)₂片段，F(ab’)₂片段指包含抗體的F(ab)₂以及抗體全部鉸鏈區的一種抗體片段；還原F(ab’)₂片段重鏈間的二硫鍵形成帶有自由巰基的片段，即抗體F(ab’)片段；

2)羧基微球加入活化劑，35～38℃活化孵育0.5～1小時，除去活化劑，然后與抗體F(ab’)片段以巰基偶聯的方式實現定向偶聯，形成抗體微球復合物。

3.根據權利要求2所述的定向偶聯方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)抗體F(ab’)₂片段的制備：向抗體中加入蛋白酶進行酶切反應，4～40℃反應0.5～4小時后終止反應，得到F(ab’)₂片段；

(2)抗體F(ab’)₂片段的還原：向步驟(1)得到的F(ab’)₂片段中加入還原劑，4～40℃條件下反應0.5～2小時，純化得到含有自由巰基的F(ab’)片段；

(3)F(ab’)片段與微球偶聯：羧基微球加入活化劑，35～38℃活化孵育0.5～1小時，除去活化劑，加入步驟(2)得到的含有自由巰基的F(ab’)片段，使之以巰基偶聯的方式定向偶聯到微球上。

4.根據權利要求3所述的定向偶聯方法，其特征在于，步驟(1)所述的蛋白酶為胃蛋白酶；蛋白酶的濃度為30～200U/mg抗體。

5.根據權利要求4所述的定向偶聯方法，其特征在于，步驟(1)所述的蛋白酶的濃度為50～100U/mg抗體。

6.根據權利要求5所述的定向偶聯方法，其特征在于，步驟(1)所述的蛋白酶的濃度為60U/mg抗體。

7.根據權利要求3所述的定向偶聯方法，其特征在于，步驟(2)所述的還原劑包括但不限于TCEP、DTT、β-巰基乙醇、β-巰基乙胺中的一種或多種；所述還原劑的濃度在0.2～50mM。

8.根據權利要求7所述的定向偶聯方法，其特征在于，步驟(2)所述的還原劑為β-巰基乙胺；所述還原劑的濃度在0.2～10mM。

9.根據權利要求8所述的定向偶聯方法，其特征在于，所述還原劑的濃度為2mM。

10.根據權利要求1所述的定向偶聯方法，其特征在于，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與羧基微球的摩爾比為0.2:1～10:1。

11.權利要求1所述的定向偶聯方法形成的抗體微球復合物。

12.一種組合物，包含權利要求11所述抗體微球復合物和藥學上的常用輔料。

13.權利要求1～6任一項所述的方法、權利要求11所述的抗體微球復合物或權利要求12所述的組合物在制備免疫診斷或檢測試劑中的應用。

14.權利要求1～6任一項所述的方法、權利要求11所述的抗體微球復合物或權利要求12所述的組合物在制備治療疾病藥物中的應用。