[發明專利]一種分離制備牙髓干細胞的方法

有效

• 申請號: 201710959618.4
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107502588B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發明（設計）人: 楊曉光;鮑永利;王雪;李玉新;石曉川;李首一
• 申請（專利權）人: 吉林省太陽鳥再生醫學工程有限責任公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿;趙青朵

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種分離制備牙髓干細胞的方法。

背景技術

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，具有再生各種組織器官和完整個體的潛在功能。干細胞的來源有很多，包括骨髓、臍帶、臍帶血、牙齒、脂肪、皮膚及毛囊等。

間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是可形成多種細胞類型的多能干細胞。具有多向分化潛能、能支持造血和促進造血干細胞植入、調節免疫以及分離培養操作簡便等特點，正日益受到人們的關注。隨著間充質干細胞及其相關技術的日益成熟，許多難治愈的疾病，有了新的治療方法。

牙髓干細胞(Dental Pulp Stem Cells，DPSCs)屬于多功能的成體干細胞，是從牙髓組織中分離出的間充質干細胞。現在牙髓干細胞已經被證實具有多向分化能力，能夠分化為骨、脂肪和血管內皮等組織細胞。現已有研究表明，牙髓干細胞能夠用于牙本質、牙髓、牙體、牙冠的組織修復與再生，還可以用于顱骨、頜骨及面骨的損傷修復。牙髓干細胞在其他疾病方面的研究應用也有很多，例如：牙髓干細胞可以用于治療腦血管意外損傷、脊髓損傷、帕金森氏病、心肌梗死、糖尿病和免疫缺陷性等疾病。牙髓干細胞的增殖力強、組織相容性高、儲存方便，給了現代人第2次儲存干細胞的機會。

目前牙髓干細胞制備方法常用的有酶聯合消化法、組織塊培養法和組織塊酶消化法等方法，各種方法雖均能獲得牙髓干細胞，但由于口腔中細菌種類繁雜，牙髓干細胞在制備及培養過程中極易污染，且分離提取出來的牙髓干細胞數量較少，細胞生長緩慢，導致牙髓干細胞制備困難，這也是目前存儲牙髓干細胞遇到的最大難題。因此，在制備牙髓干細胞時通常選擇加入抗生素以抑制細菌繁殖，在干細胞培養中常用的抗生素種類有：抑制細菌常用青霉素和鏈霉素，抑制真菌常用兩性霉素和制霉菌素，抑制支原體污染常用慶大霉素、四環素及紅霉素對等。但是以上抗生素的應用并不能確保牙髓干細胞不被污染。

氯化兩面針堿(Nitidine chloride)是由蕓香科花椒屬植物兩面針的干燥根中提取的一種有效生物堿，兩面針：性辛、苦、微溫，有小毒，歸肝、腎經，用于治療胃痛、牙痛、神經痛、風濕骨痛、毒蛇咬傷等多種病癥。氯化兩面針堿是兩面針的主要有效成分，是兩面針及其制劑的主要質量控制指標成分，近年來研究發現氯化兩面針堿高效低毒，具有抗腫瘤、強心、降血壓、抗真菌等藥理作用。

透明質酸是一種酸性粘多糖，與其鹽類是構成人體細胞間質、眼玻璃體、關節軟骨、關節滑液等結締組織的主要成分。透明質酸在人體的生理活動中發揮著至關重要的作用，如果關節腔、血管、心臟、眼、腦等組織器官中的透明質酸含量下降，可能會導致關節炎、動脈硬化、脈搏紊亂和腦萎縮等疾病。透明質酸是一種分布在多種組織細胞外基質中的蛋白多糖，具有良好生物相容性，并在生物發育和機體損傷修復過程中發揮重要作用，其已成為一種有前景的醫藥生物材料，在三維細胞培養、組織工程支架以及再生醫學領域得到廣泛的應用。

明膠(Gelatin)是一種高分子量的水溶性蛋白混合物，主要存在于膠原中。通過煮沸皮膚、筋腱、韌帶、骨頭等獲得。A型明膠通過酸水解組織獲得，而B型明膠通過石灰水解組織獲得。明膠在食物中可以用作穩定劑和增稠劑，在細菌學和細胞培養中可抑制結晶，也可用于雜交反應等。質量好的明膠蛋白質含量高、顏色為白色，完全溶于水，水溶解后無異味，是無毒無刺激性原料，已收載于FDA《非活性組分指南》，適用于牙用制劑、吸入制劑、注射劑、口服膠囊、錠劑、溶液劑、糖漿劑、片劑、外用制劑和陰道制劑，是英國準許用于醫藥品中的一種原料之一。

牙髓干細胞在制備過程中不僅極易污染，導致細胞數量較少，生長緩慢。并且，還常因為牙髓間充質干細胞不易貼壁造成細胞損失。但是，目前尚未有報道稱通過怎樣的手段能夠解決這些問題，因此，進一步提高牙髓干細胞分離培養的效率，仍是本領域亟待解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種分離制備牙髓干細胞的方法，本發明提供的方法污染率低，貼壁時間短，獲得細胞的數量多。

本發明提供了氯化兩面針堿在牙髓間充質干細胞分離制備中的應用。

現有技術研究表明，氯化兩面針堿有抗腫瘤、強心、降血壓、抗真菌等藥理作用。本發明研究表明，其能夠對牙齒或牙髓組織消毒，避免細菌、真菌或支原體感染，從而提高了培養細胞的獲得率。

本發明提供了一種牙髓間充質干細胞培養液，其由胎牛血清、轉鐵蛋白、雙抗、氯化兩面針堿和DMEM/F12培養基組成。