[發明專利]PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗及制備方法

在審

• 申請號: 201710956948.8
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107982528A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 任紅濤;劉健鵬;鄒權
• 申請（專利權）人: 北京生科基因科技有限公司;榆林市動物疫病預防控制中心;墊江縣動物衛生監督所
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;C12N15/866;C12N15/34;A61P31/20
• 代理公司: 北京智沃律師事務所11620
• 代理人: 王繼勝

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗及其制備方法。

背景技術

豬圓環病毒(Porcine circovirus，PCV)屬于圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬(Circovirus)，為無包膜的單鏈環狀DNA病毒，是目前發現最小DNA病毒。根據基因組成和病毒抗原性，PCV分為兩種血清型，PCV1型和PCV2型。其中PCV1為不致病型，PCV2為致病型。

豬圓環病毒病(PCVD)是由PCV2病毒引起的豬傳染性疾病，是豬重要的免疫抑制性疾病，該病在豬群中發病嚴重，已給全球養豬業造成巨大的經濟損失。PCV2被認為是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥(PWMS)的主要病原，它不僅可以導致斷奶仔豬發生衰竭、死亡，還與仔豬A2型先天性震顫(AII，CT)、懷孕母豬流產、成年豬皮炎腎炎綜合癥(PDNS)和呼吸道疾病綜合癥(PRDS)密切相關，是全球公認嚴重危害養豬業的傳染病之一。近年來，我國PCV2病毒感染呈上升趨勢。

PCV2基因組全長1768bp，有11個開放閱讀框，ORF1-ORF11。其中ORF1和ORF2為兩個主要開放閱讀框。ORF1編碼與病毒復制相關的酶蛋白，參與病毒復制。ORF2編碼病毒的衣殼蛋白，是該病毒的主要免疫原性蛋白。研究表明，在適當條件下，ORF2蛋白可組裝成病毒樣顆粒(Virus-Like-Particles,VLPs)，VLPs與PCV2病毒粒子具有相似外形，且不含有核酸。免疫動物可誘導產生PCV2病毒中和抗體，是研制基因工程疫苗的重點對象。

疫苗預防接種是控制PCV2引起的豬圓環病毒病(PCVD)的最有效手段。目前豬圓環病毒疫苗主要有全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗和弱毒活疫苗。其中國內基本為滅活疫苗。PCV2病毒不易在細胞上增殖，生產病毒滴度低；此外PCV2滅活疫苗還存在著滅活效果難檢測，免疫期短，需多次接種免疫，生產成本遠高于其他病毒滅活疫苗等問題。弱毒活疫苗則存在著毒力返祖及散毒等潛在危險，且免疫原性差。

目前，PCV2亞單位疫苗中的PCV2病毒樣顆粒(Virus-Like-Particle,VLP)疫苗是研制基因工程疫苗的重點。VLP疫苗不僅有良好的免疫原性，而且安全性好，可誘導機體產生體液免疫和細胞免疫。大腸桿菌表達系統雖然具有易培養、安全性高等優點，但表達的外源基因蛋白不可溶、且缺乏生物活性和免疫原性。昆蟲桿狀病毒表達系統在病毒樣顆粒(VLP)的構建和應用方面具有明顯的優勢。昆蟲桿狀病毒表達系統能夠對外源蛋白進行信號肽切除、糖基化等加工修飾；具有強啟動子，可加強目的蛋白的轉錄翻譯；可容納10kb左右的外源基因，并可同時進行多個外源片段的表達；具有明顯的宿主界限，對脊椎動物無致病性，安全性高。Merck公司的Circumvent-PCVM和勃林格公司的CircoFlex疫苗均采用昆蟲桿狀病毒表達PCV2衣殼蛋白，再將其制備成疫苗。該疫苗被證實具有使用劑量少，免疫效果好等優點，對歐洲及北美的PCV2病毒控制發揮了巨大作用。桿狀病毒表達系統雖然存在著生產成本低、蛋白表達量高等優點，但由于它對生產工藝、生產技術及生產設備等方面的高要求，限制了該表達系統在我國PCV2疫苗生產上的推廣與使用。

因此，一種免疫性高、安全性好、可工業化生產的PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗是國內PCV2疫苗生產所需要的。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的問題之一。

本發明要解決的技術問題之一在于解決國內缺乏高免疫原性PCV2疫苗的問題，為國內提供一種免疫性高、安全性好、可工業化生產的PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗的制備方法。

為解決上述技術問題，本發明提供一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗及其制備方法。

所述PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗以昆蟲作為宿主細胞，轉染包含PCV2重組桿狀病毒ORF2基因片段的真核表達載體。

所述PCV2重組桿狀病毒ORF2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述真核表達載體為pAcGP67-A-PCV2，是將PCV2重組桿狀病毒ORF2基因片段克隆到pAcGP67-A載體中的EcoR1/BglII雙酶切位點而得到的；所述昆蟲為昆蟲中的Sf9細胞系。