[發明專利]PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗及制備方法

在審

• 申請號: 201710956948.8
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN107982528A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 任紅濤;劉健鵬;鄒權
• 申請（專利權）人: 北京生科基因科技有限公司;榆林市動物疫病預防控制中心;墊江縣動物衛生監督所
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;C12N15/866;C12N15/34;A61P31/20
• 代理公司: 北京智沃律師事務所11620
• 代理人: 王繼勝

1.一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗，其特征在于，所述PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗以昆蟲作為宿主細胞，轉染包含PCV2重組桿狀病毒ORF2基因片段的真核表達載體。

2.根據權利要求1所述的一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗，其特征在于，所述PCV2重組桿狀病毒ORF2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求1或2所述的一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗，其特征在于，所述真核表達載體為pAcGP67-A-PCV2，是將PCV2重組桿狀病毒ORF2基因片段克隆到pAcGP67-A載體中的EcoR1/BglII雙酶切位點而得到的；所述昆蟲為昆蟲中的Sf9細胞系。

4.一種真核表達載體，其特征在于，該真核表達載體為pAcGP67-A-PCV2，是將PCV2重組桿狀病毒ORF2基因片段克隆到pAcGP67-A載體中的EcoR1/BglII雙酶切位點而得到的。

5.一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述方法利用分子生物學手段構建含有高免疫原性PCV2ORF2核苷酸序列的重組桿狀病毒，所述重組病毒能夠在Sf9細胞系中高效表達PCV2衣殼蛋白，并在胞質內組裝成具有PCV2表面抗原的PCV2病毒樣顆粒，具體包括如下步驟：

(1)采用BD BaculoGold桿狀病毒表達系統，將PCV2重組桿狀病毒ORF2核苷酸序列通過EcoR1/BglII雙酶切連接到pAcGP67-A穿梭載體內，BD BaculoGold^TM線性桿狀病毒DNA與pAcGP67-A穿梭載體共轉染Sf9細胞獲得重組桿狀病毒，篩選高滴度重組桿狀病毒作為生產用毒種；

(2)采用細胞生物反應器對Sf9細胞進行全懸浮無血清培養，當細胞密度培養至1.5-2×10⁶cells/ml，利用步驟(1)中篩選的高滴度重組桿狀病毒進行感染，全懸浮無血清培養5-7天，收獲病毒，蛋白生產量可達200～300mg/l，表達蛋白可形成病毒樣顆粒；

(3)對收獲的病毒原液進行過濾系統處理和滅活，輔之以佐劑，制成免疫性高、安全性好的PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗。

6.根據權利要求5所述的一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中PCV2ORF2核苷酸序列為GenBankAIT11738.1序列，是PCV2重組桿狀病毒ORF2核苷酸序列的質粒pUC57-PCV2根據穿梭載體pAcGP67-A多克隆位點序列，分別在ORF2序列5’端和3’端加入EcoR1和BglII酶切位點；所述PCV2重組桿狀病毒ORF2核苷酸全長713bp，具體序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根據權利要求5所述的一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中無血清培養基為EX-CELL^TM 420無血清培養基；Sf9細胞在細胞生物反應器中的培養條件為：細胞接種量為2-5×10⁵cells/ml，細胞生物反應器轉速為80-90rpm，培養溫度為26-28℃，溶氧值60％-80％，pH值為6.2-6.5；高滴度重組桿狀病毒接種量MOI為1-10，培養溫度為26-28℃，pH值為6.2-6.5。

8.根據權利要求5或7所述的一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中表達蛋白為重組桿狀病毒表達的PCV2衣殼蛋白，具體氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

9.根據權利要求5所述的一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗采用的滅活劑為二乙烯亞胺；滅活步驟為5mM二乙烯亞胺在37℃滅活72小時。

10.根據權利要求5或9所述的一種PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中PCV2重組桿狀病毒樣顆粒亞單位疫苗抗原佐劑選用5984EP聚合物，終濃度為01.～0.5mg/ml。