[發(fā)明專利]還原性糖鏈和糖蛋白O-糖鏈的氨基吡唑啉酮類異二官能團(tuán)試劑衍生化及分離分析方法

有效

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• 申請日: 2017-10-13
• 公開（公告）號: CN107796889B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王仲孚;王承健;路宇;黃琳娟;柳人丹;溫婭楠
• 申請（專利權(quán)）人: 西北大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 西安智萃知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 61221
• 代理人: 李炳輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于糖生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及還原性糖鏈和糖蛋白O-糖鏈的氨基吡唑啉酮類異二官能團(tuán)試劑衍生化及分離分析方法。

背景技術(shù)

糖類物質(zhì)作為構(gòu)建生命體的第三類生物大分子，具有十分重要生物學(xué)功能，如為生物體提供能量物質(zhì)，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要組成部分，在細(xì)胞的分化、發(fā)育、腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、識別、免疫應(yīng)答等發(fā)揮著重要的作用。糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最主要的修飾之一，在蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控、蛋白質(zhì)降解等過程中起著非常重要的作用。50％以上的蛋白質(zhì)以糖蛋白的形式存在，并且越來越多的研究表明，糖基化異常可導(dǎo)致人類疾病。在臨床治療過程中，使用的抗體藥物均帶有糖基化。

目前，大量的研究表明，糖蛋白上的糖鏈的異常變化和許多疾病有關(guān)，因此以研究糖鏈的結(jié)構(gòu)和功能為主要內(nèi)容的功能糖組學(xué)吸引了生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛的關(guān)注，尤其是以糖鏈作為研究對象來篩選癌癥血清標(biāo)志物的研究，為人類癌癥的早期診斷、預(yù)后、治療、反應(yīng)預(yù)測和群體篩查開辟了新的途徑，例如，糖蛋白的糖鏈末端常常會發(fā)生唾液酸化修飾，它不僅可穩(wěn)定糖鏈結(jié)構(gòu)，而且與許多惡性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；因此對糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)解析顯得十分的重要。

但由于天然存在的糖類物質(zhì)本身不含有發(fā)色基團(tuán)，用高效液相色譜儀對其進(jìn)行分離檢測遇到困難，而衍生化不僅可以使糖鏈帶上紫外或熒光基團(tuán)，提高檢測靈敏度，又可以降低糖鏈極性，使糖鏈在色譜柱上保留，便于糖鏈分離。衍生化技術(shù)通過給糖鏈C-1端半縮醛結(jié)構(gòu)帶上疏水性化學(xué)基團(tuán)，改善糖鏈結(jié)構(gòu)的疏水性，提高糖類物質(zhì)的離子化效率，進(jìn)而可提高糖類物質(zhì)在MS檢測分析中的靈敏度。

目前針對還原性糖鏈C-1末端醛基的柱前衍生化技術(shù)主要有：(1)還原胺化法，例如3-氨基-9-乙基咔唑(簡稱AEC)衍生化；(2)與吡唑啉酮的堿性縮合反應(yīng)，如，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(簡稱PMP)；(3)肼類試劑成腙反應(yīng)，常用苯肼、吉拉德T試劑等。但是，上述衍生化試劑都只帶有一個(gè)官能團(tuán)，在對糖鏈衍生化之后，衍生產(chǎn)物缺乏游離的活性官能團(tuán)，無法用于糖鏈的進(jìn)一步分析，如糖芯片構(gòu)建、磁球固定化及熒光標(biāo)記等。

隨著糖組學(xué)的發(fā)展，為了便于糖鏈的進(jìn)一步分析，用于糖鏈衍生化的雙官能團(tuán)衍生化試劑開發(fā)非常重要，這類試劑具有兩個(gè)活性官能團(tuán)，其中一個(gè)官能團(tuán)可以用于標(biāo)記糖鏈的還原端，另一個(gè)官能團(tuán)可為后續(xù)糖芯片構(gòu)建、磁球固定化及熒光標(biāo)記等提供反應(yīng)位點(diǎn)，用于功能性分析。這類試劑報(bào)道較少，主要有2，6-二氨基吡啶(簡稱DAP)和N-氨基乙基-2-氨基苯甲酰胺(簡稱AEAB)這兩種，但是它們均攜帶兩個(gè)氨基，易產(chǎn)生競爭作用，與糖鏈反應(yīng)時(shí)選擇性不強(qiáng)，且只能應(yīng)用于還原性糖鏈的衍生化，對于糖蛋白上的O-糖鏈并不適用。

鑒于以上問題，開發(fā)新的、衍生化效率更高的利用具有兩個(gè)不同活性官能團(tuán)的異二官能團(tuán)試劑對還原性糖鏈進(jìn)行衍生化的方法對于糖組學(xué)的研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中對還原性糖鏈進(jìn)行衍生化的方法反應(yīng)條件苛刻，衍生化效率不高，且衍生化試劑僅含一個(gè)活性官能團(tuán)，不能實(shí)現(xiàn)糖鏈的進(jìn)一步分析等缺陷，本發(fā)明一方面提供還原性糖鏈的氨基吡唑啉酮類異二官能團(tuán)試劑衍生化方法，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

還原性糖鏈的氨基吡唑啉酮類異二官能團(tuán)試劑衍生化方法，具體為還原性糖鏈與氨基吡唑啉酮類異二官能團(tuán)試劑3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，在酸性條件下發(fā)生還原胺化反應(yīng)，生成具有活性亞甲基的糖鏈衍生物；或在堿性條件下發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，生成具有伯氨基的糖鏈衍生物；

所述還原性糖鏈為游離還原性糖鏈或糖蛋白上釋放的糖鏈，其中，所述游離還原性糖鏈為從植物、動物中提取的還原性糖鏈或合成得到的還原性糖鏈。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的還原性糖鏈的氨基吡唑啉酮類異二官能團(tuán)試劑衍生化方法，包括以下步驟：

步驟(1A)：將還原性糖鏈加入3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與質(zhì)子型溶劑配制得到的溶液中，所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在溶液中的濃度小于1mol/L,所述反應(yīng)體系中3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與還原性糖鏈的摩爾濃度之比大于或等于10:1；

步驟(2A)：向反應(yīng)體系中加入有機(jī)弱酸，所述有機(jī)弱酸在反應(yīng)體系中的體積百分比為7％～25％，反應(yīng)體系的pH大于3且小于6，加熱至65℃～75℃，反應(yīng)1小時(shí)～2小時(shí)；

步驟(3A)：反應(yīng)結(jié)束后，向步驟(2A)的反應(yīng)體系中加入氰基硼氫化鈉，所述氰基硼氫化鈉與還原性糖鏈的物質(zhì)的量之比大于或等于20:1；