[發明專利]一種L-高絲氨酸的生產菌株及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201710953111.8
• 申請日: 2017-10-13
• 公開（公告）號: CN109666617B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 謝新開;徐偉
• 申請（專利權）人: 四川利爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京永新同創知識產權代理有限公司 11376
• 代理人: 程大軍

本發明提供一種L?高絲氨酸的生產菌株，其特征在于：其具有單一穩定的染色體，不含質粒形式或其他游離DNA載體，其染色體DNA上一個或多個與L?蘇氨酸合成相關的基因被敲除或弱化，和/或被突變以增強，和/或其染色體DNA上整合拷貝一個或多個與L?高絲氨酸代謝途徑相關的基因。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種L-高絲氨酸的生產菌株及其構建方法和應用。

背景技術

L-高絲氨酸是一種天然存在的非蛋白氨基酸，作為生物合成蘇氨酸、蛋氨酸和賴氨酸共有的中間體而少量存在于很多物種中。由于L-高絲氨酸具有L-型-α氨基酸的基本骨架，并且其γ-羥基具有多樣的化學活性，因此，L-高絲氨酸及其衍生物作為醫藥中間體在藥物學、生理學等方面有重要應用前景。

目前，國內外生產L-高絲氨酸主要有以下幾種方法：

(1)化學法；該方法采用相對昂貴的L-蛋氨酸為原料，并使用具有嚴重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作為甲基化試劑，經親核進攻以保護氨基，再在弱堿性條件下水解得到產物。該方法不僅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，對環境不友好；

(2)化學手性拆分方法；該方法是利用混旋的高絲氨酸與手性試劑反應后，會形成非對應異構體的性質差異，由此分離出L-高絲氨酸。該方法產率低，試劑成本高且需使用大量有機溶劑，對環境有較大污染威脅。

(3)生物酶催化法；該方法利用丙酮酸和甲醛在縮醛酶和L-氨基酸脫氫酶的共同作用下生成氨基酸高絲氨酸。該方法主要問題是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用價格昂貴的輔酶等。

(4)微生物發酵法；該方法具有成本低、條件溫和、環境污染少等諸多優點，近年來已經成為生產各類氨基酸的首選工藝。但是，目前的L-高絲氨酸發酵依賴于以質粒為載體的基因過表達體系，其劣勢是菌種傳代穩定性差。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一種穩定的L-高絲氨酸的生產菌株。

本發明要解決的第二個技術問題是提供一種構建L-高絲氨酸生產菌株的基因工程方法。

因此，本發明提供一種L-高絲氨酸的生產菌株，其特征在于：其具有單一穩定的染色體，不含質粒形式或其他游離DNA載體，其染色體DNA上一個或多個與L-蘇氨酸合成相關的基因被敲除或弱化，和/或被突變以增強，和/或其染色體DNA上整合拷貝一個或多個與L-高絲氨酸代謝途徑相關的基因。

優選地，所述被敲除或弱化的基因為thrB和/或thrL；所述被突變以增強的基因為thrA和/或rhtA，所述整合拷貝的基因為thrA*、ppc、pntA、pntB、asd、aspA和aspC中的一個或多個。

優選地，所述L-高絲氨酸生產菌株屬于大腸桿菌種屬。

進一步優選地，所述菌株為大腸桿菌K-12野生型MG1655。

本發明還提供所述的L-高絲氨酸生產菌株的構建方法，包括以下步驟中一步或多步：

A、構建菌株中一個或多個與L-高絲氨酸代謝途徑相關的基因被敲除或弱化；

B、構建菌株中一個或多個與L-高絲氨酸代謝途徑相關的基因通過點突變過表達或增強功能；

C、構建菌株中一個或多個與L-高絲氨酸代謝途徑相關的基因以多拷貝的形式整合到染色體DNA上過表達。

優選地，所述步驟A中所述的被敲除或弱化的基因為thrB和/或thrL；

所述步驟B中所述的被突變的基因為thrA和/或rhtA；