[發(fā)明專利]副豬嗜血桿菌病4型、5型二價(jià)滅活疫苗效力的檢驗(yàn)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710951910.1
• 申請(qǐng)日: 2017-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN107589256A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 厚華艷;呂茂杰;李蓬飛;付旭彬;郁宏偉;梁武;李守軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/558
• 分類號(hào): G01N33/558;A61K39/116;A61K39/102;A61P31/04
• 代理公司: 天津合志慧知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)12219
• 代理人: 陳松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及疫苗的效力評(píng)價(jià)技術(shù)，具體涉及副豬嗜血桿菌病4型、5型二價(jià)滅活疫苗效力的檢驗(yàn)方法。

背景技術(shù)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌，為豬Glasser’s病(副豬嗜血桿菌病)的病原菌。常可在鼻腔、扁桃體和氣管前段分離到，而不見任何臨床癥狀，當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)或引起免疫抑制的因素存在時(shí)，會(huì)導(dǎo)致該病發(fā)生。HPS只感染豬，可以侵害2周齡至4月齡的仔豬，多發(fā)于5～8周齡，發(fā)病率可達(dá)40％，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)50％。

HPS血清型眾多，按Kieletein-Rapp-Gabriedon(KRG)血清分型方法至少可將副豬嗜血桿菌分為15個(gè)血清型，由于一些菌株不表達(dá)足夠多的型特異性抗原，大約有20％左右的分離株不能分型。不同血清型HPS菌株其毒力和致病力存在差異，其中血清型1、5、10、12、13、14毒力最強(qiáng)，血清型2、4、15為中等毒力，血清型3、6、7、8、9、11毒株感染癥狀較緩和或無臨床表現(xiàn)，在我國HPS血清型4、5、12、13型較為流行。

目前，市場上有多家疫苗公司均在生產(chǎn)和銷售副豬嗜血桿菌單價(jià)、多價(jià)滅活疫苗，副豬嗜血桿菌滅活疫苗傳統(tǒng)效力檢驗(yàn)方法為攻毒保護(hù)試驗(yàn)，豬只免疫疫苗后通過強(qiáng)毒攻擊，與對(duì)照組相比，確定疫苗的保護(hù)效力。此方法評(píng)價(jià)疫苗的效力直觀，但是歷時(shí)時(shí)間長，試驗(yàn)進(jìn)行期間需要攻毒，存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)試驗(yàn)成本較高，效力檢驗(yàn)使用動(dòng)物、操作人員、攻毒菌液制備、飼養(yǎng)環(huán)境等條件導(dǎo)致攻毒保護(hù)試驗(yàn)批間差異較大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供副豬嗜血桿菌病4型、5型二價(jià)滅活疫苗效力的檢驗(yàn)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)疫苗效力的方法存在檢驗(yàn)耗時(shí)長、成本高、結(jié)果不穩(wěn)定等技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

副豬嗜血桿菌病4型、5型二價(jià)滅活疫苗效力的檢驗(yàn)方法，包括以下步驟：

1)分別制備副豬嗜血桿菌4型單價(jià)滅活疫苗和副豬嗜血桿菌5型單價(jià)滅活疫苗，依據(jù)《中國獸藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)疫苗，合格品分別作為4型疫苗參照品和5型疫苗參照品；

2)取待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗，以及步驟1)所得的4型疫苗參照品和5型疫苗參照品，采用相同方法分別免疫豚鼠，而后采血，通過間接ELISA方法分別檢測抗體滴度，比較待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗所免疫的血清抗體滴度與4型疫苗參照品、5型疫苗參照品所免疫的血清抗體滴度之間的數(shù)值關(guān)系。

作為優(yōu)選，步驟2)所述的相同方法為：先對(duì)豚鼠進(jìn)行首次免疫，2周后再次免疫接種1次，二免后2周，免疫結(jié)束。

作為優(yōu)選，所述通過間接ELISA方法分別檢測抗體滴度，包括以下操作：

A)將副豬嗜血桿菌抗原用包被液進(jìn)行稀釋，加至96孔板中，100μL/孔；

B)室溫孵育30min，用PBS清洗96孔板3遍；

C)加入封閉液，100μL/孔；對(duì)照組血清、免疫組血清和標(biāo)準(zhǔn)血清分別加入至第一列，倍比稀釋至第10列，第11和12列分別加入16倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；

D)室溫孵育1h，洗96孔板3次；

E)以100μL/孔的量向其中加入以封閉液進(jìn)行了1:2000(v:v)倍稀釋的HRP標(biāo)記的抗豚鼠IgG，37℃孵育1小時(shí)；

F)洗液洗96孔板3次；

G)加入100μL/孔OPD底液，室溫孵育15min；

H)50μL/孔終止液終止反應(yīng)；

I)492nm條件下測定OD值。

作為優(yōu)選，所述比較待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗所免疫的血清抗體滴度與4型疫苗參照品、5型疫苗參照品所免疫的血清抗體滴度之間的數(shù)值關(guān)系，是分別計(jì)算待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗所免疫血清中4型抗體滴度與4型疫苗參照品所免疫血清中抗體滴度之間比值，以及待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗所免疫血清中5型抗體滴度與5型疫苗參照品所免疫血清中抗體滴度之間比值；上述兩個(gè)比值均大于或等于1時(shí)，檢驗(yàn)結(jié)果為合格，否則檢驗(yàn)結(jié)果為不合格。