[發明專利]副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法

在審

• 申請號: 201710951910.1
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107589256A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 厚華艷;呂茂杰;李蓬飛;付旭彬;郁宏偉;梁武;李守軍
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;A61K39/116;A61K39/102;A61P31/04
• 代理公司: 天津合志慧知識產權代理事務所(普通合伙)12219
• 代理人: 陳松

技術領域

本發明涉及獸用生物制品技術領域，進一步涉及疫苗的效力評價技術，具體涉及副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法。

背景技術

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌，為豬Glasser’s病(副豬嗜血桿菌病)的病原菌。?？稍诒乔?、扁桃體和氣管前段分離到，而不見任何臨床癥狀，當環境發生變化時或引起免疫抑制的因素存在時，會導致該病發生。HPS只感染豬，可以侵害2周齡至4月齡的仔豬，多發于5～8周齡，發病率可達40％，嚴重時高達50％。

HPS血清型眾多，按Kieletein-Rapp-Gabriedon(KRG)血清分型方法至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型，由于一些菌株不表達足夠多的型特異性抗原，大約有20％左右的分離株不能分型。不同血清型HPS菌株其毒力和致病力存在差異，其中血清型1、5、10、12、13、14毒力最強，血清型2、4、15為中等毒力，血清型3、6、7、8、9、11毒株感染癥狀較緩和或無臨床表現，在我國HPS血清型4、5、12、13型較為流行。

目前，市場上有多家疫苗公司均在生產和銷售副豬嗜血桿菌單價、多價滅活疫苗，副豬嗜血桿菌滅活疫苗傳統效力檢驗方法為攻毒保護試驗，豬只免疫疫苗后通過強毒攻擊，與對照組相比，確定疫苗的保護效力。此方法評價疫苗的效力直觀，但是歷時時間長，試驗進行期間需要攻毒，存在生物安全風險，同時試驗成本較高，效力檢驗使用動物、操作人員、攻毒菌液制備、飼養環境等條件導致攻毒保護試驗批間差異較大。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法，以解決現有技術中通過攻毒保護試驗評價疫苗效力的方法存在檢驗耗時長、成本高、結果不穩定等技術問題。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法，包括以下步驟：

1)分別制備副豬嗜血桿菌4型單價滅活疫苗和副豬嗜血桿菌5型單價滅活疫苗，依據《中國獸藥典》質量標準檢驗疫苗，合格品分別作為4型疫苗參照品和5型疫苗參照品；

2)取待測的4型、5型二價滅活疫苗，以及步驟1)所得的4型疫苗參照品和5型疫苗參照品，采用相同方法分別免疫豚鼠，而后采血，通過間接ELISA方法分別檢測抗體滴度，比較待測的4型、5型二價滅活疫苗所免疫的血清抗體滴度與4型疫苗參照品、5型疫苗參照品所免疫的血清抗體滴度之間的數值關系。

作為優選，步驟2)所述的相同方法為：先對豚鼠進行首次免疫，2周后再次免疫接種1次，二免后2周，免疫結束。

作為優選，所述通過間接ELISA方法分別檢測抗體滴度，包括以下操作：

A)將副豬嗜血桿菌抗原用包被液進行稀釋，加至96孔板中，100μL/孔；

B)室溫孵育30min，用PBS清洗96孔板3遍；

C)加入封閉液，100μL/孔；對照組血清、免疫組血清和標準血清分別加入至第一列，倍比稀釋至第10列，第11和12列分別加入16倍稀釋的標準陰性血清和標準陽性血清；

D)室溫孵育1h，洗96孔板3次；

E)以100μL/孔的量向其中加入以封閉液進行了1:2000(v:v)倍稀釋的HRP標記的抗豚鼠IgG，37℃孵育1小時；

F)洗液洗96孔板3次；

G)加入100μL/孔OPD底液，室溫孵育15min；

H)50μL/孔終止液終止反應；

I)492nm條件下測定OD值。

作為優選，所述比較待測的4型、5型二價滅活疫苗所免疫的血清抗體滴度與4型疫苗參照品、5型疫苗參照品所免疫的血清抗體滴度之間的數值關系，是分別計算待測的4型、5型二價滅活疫苗所免疫血清中4型抗體滴度與4型疫苗參照品所免疫血清中抗體滴度之間比值，以及待測的4型、5型二價滅活疫苗所免疫血清中5型抗體滴度與5型疫苗參照品所免疫血清中抗體滴度之間比值；上述兩個比值均大于或等于1時，檢驗結果為合格，否則檢驗結果為不合格。