[發(fā)明專利]副豬嗜血桿菌病4型、5型二價(jià)滅活疫苗效力的檢驗(yàn)方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201710951910.1 | 申請(qǐng)日: | 2017-09-30 |
| 公開(公告)號(hào): | CN107589256A | 公開(公告)日: | 2018-01-16 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 厚華艷;呂茂杰;李蓬飛;付旭彬;郁宏偉;梁武;李守軍 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司 |
| 主分類號(hào): | G01N33/558 | 分類號(hào): | G01N33/558;A61K39/116;A61K39/102;A61P31/04 |
| 代理公司: | 天津合志慧知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)12219 | 代理人: | 陳松 |
| 地址: | 300308 天津市濱海新*** | 國省代碼: | 天津;12 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 嗜血 桿菌 二價(jià) 疫苗 效力 檢驗(yàn) 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域,進(jìn)一步涉及疫苗的效力評(píng)價(jià)技術(shù),具體涉及副豬嗜血桿菌病4型、5型二價(jià)滅活疫苗效力的檢驗(yàn)方法。
背景技術(shù)
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌,為豬Glasser’s病(副豬嗜血桿菌病)的病原菌。常可在鼻腔、扁桃體和氣管前段分離到,而不見任何臨床癥狀,當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)或引起免疫抑制的因素存在時(shí),會(huì)導(dǎo)致該病發(fā)生。HPS只感染豬,可以侵害2周齡至4月齡的仔豬,多發(fā)于5~8周齡,發(fā)病率可達(dá)40%,嚴(yán)重時(shí)高達(dá)50%。
HPS血清型眾多,按Kieletein-Rapp-Gabriedon(KRG)血清分型方法至少可將副豬嗜血桿菌分為15個(gè)血清型,由于一些菌株不表達(dá)足夠多的型特異性抗原,大約有20%左右的分離株不能分型。不同血清型HPS菌株其毒力和致病力存在差異,其中血清型1、5、10、12、13、14毒力最強(qiáng),血清型2、4、15為中等毒力,血清型3、6、7、8、9、11毒株感染癥狀較緩和或無臨床表現(xiàn),在我國HPS血清型4、5、12、13型較為流行。
目前,市場上有多家疫苗公司均在生產(chǎn)和銷售副豬嗜血桿菌單價(jià)、多價(jià)滅活疫苗,副豬嗜血桿菌滅活疫苗傳統(tǒng)效力檢驗(yàn)方法為攻毒保護(hù)試驗(yàn),豬只免疫疫苗后通過強(qiáng)毒攻擊,與對(duì)照組相比,確定疫苗的保護(hù)效力。此方法評(píng)價(jià)疫苗的效力直觀,但是歷時(shí)時(shí)間長,試驗(yàn)進(jìn)行期間需要攻毒,存在生物安全風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)試驗(yàn)成本較高,效力檢驗(yàn)使用動(dòng)物、操作人員、攻毒菌液制備、飼養(yǎng)環(huán)境等條件導(dǎo)致攻毒保護(hù)試驗(yàn)批間差異較大。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷,提供副豬嗜血桿菌病4型、5型二價(jià)滅活疫苗效力的檢驗(yàn)方法,以解決現(xiàn)有技術(shù)中通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)疫苗效力的方法存在檢驗(yàn)耗時(shí)長、成本高、結(jié)果不穩(wěn)定等技術(shù)問題。
為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
副豬嗜血桿菌病4型、5型二價(jià)滅活疫苗效力的檢驗(yàn)方法,包括以下步驟:
1)分別制備副豬嗜血桿菌4型單價(jià)滅活疫苗和副豬嗜血桿菌5型單價(jià)滅活疫苗,依據(jù)《中國獸藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)疫苗,合格品分別作為4型疫苗參照品和5型疫苗參照品;
2)取待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗,以及步驟1)所得的4型疫苗參照品和5型疫苗參照品,采用相同方法分別免疫豚鼠,而后采血,通過間接ELISA方法分別檢測抗體滴度,比較待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗所免疫的血清抗體滴度與4型疫苗參照品、5型疫苗參照品所免疫的血清抗體滴度之間的數(shù)值關(guān)系。
作為優(yōu)選,步驟2)所述的相同方法為:先對(duì)豚鼠進(jìn)行首次免疫,2周后再次免疫接種1次,二免后2周,免疫結(jié)束。
作為優(yōu)選,所述通過間接ELISA方法分別檢測抗體滴度,包括以下操作:
A)將副豬嗜血桿菌抗原用包被液進(jìn)行稀釋,加至96孔板中,100μL/孔;
B)室溫孵育30min,用PBS清洗96孔板3遍;
C)加入封閉液,100μL/孔;對(duì)照組血清、免疫組血清和標(biāo)準(zhǔn)血清分別加入至第一列,倍比稀釋至第10列,第11和12列分別加入16倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清;
D)室溫孵育1h,洗96孔板3次;
E)以100μL/孔的量向其中加入以封閉液進(jìn)行了1:2000(v:v)倍稀釋的HRP標(biāo)記的抗豚鼠IgG,37℃孵育1小時(shí);
F)洗液洗96孔板3次;
G)加入100μL/孔OPD底液,室溫孵育15min;
H)50μL/孔終止液終止反應(yīng);
I)492nm條件下測定OD值。
作為優(yōu)選,所述比較待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗所免疫的血清抗體滴度與4型疫苗參照品、5型疫苗參照品所免疫的血清抗體滴度之間的數(shù)值關(guān)系,是分別計(jì)算待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗所免疫血清中4型抗體滴度與4型疫苗參照品所免疫血清中抗體滴度之間比值,以及待測的4型、5型二價(jià)滅活疫苗所免疫血清中5型抗體滴度與5型疫苗參照品所免疫血清中抗體滴度之間比值;上述兩個(gè)比值均大于或等于1時(shí),檢驗(yàn)結(jié)果為合格,否則檢驗(yàn)結(jié)果為不合格。
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