[發明專利]副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法

在審

• 申請號: 201710951910.1
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107589256A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 厚華艷;呂茂杰;李蓬飛;付旭彬;郁宏偉;梁武;李守軍
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;A61K39/116;A61K39/102;A61P31/04
• 代理公司: 天津合志慧知識產權代理事務所(普通合伙)12219
• 代理人: 陳松

1.副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法，其特征在于包括以下步驟：

1)分別制備副豬嗜血桿菌4型單價滅活疫苗和副豬嗜血桿菌5型單價滅活疫苗，依據《中國獸藥典》質量標準檢驗疫苗，合格品分別作為4型疫苗參照品和5型疫苗參照品；

2)取待測的4型、5型二價滅活疫苗，以及步驟1)所得的4型疫苗參照品和5型疫苗參照品，采用相同方法分別免疫豚鼠，而后采血，通過間接ELISA方法分別檢測抗體滴度，比較待測的4型、5型二價滅活疫苗所免疫的血清抗體滴度與4型疫苗參照品、5型疫苗參照品所免疫的血清抗體滴度之間的數值關系。

2.根據權利要求1所述的副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法，其特征在于步驟2)所述的相同方法為：先對豚鼠進行首次免疫，2周后再次免疫接種1次，二免后2周，免疫結束。

3.根據權利要求1所述的副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法，其特征在于所述通過間接ELISA方法分別檢測抗體滴度，包括以下操作：

A)將副豬嗜血桿菌抗原用包被液進行稀釋，加至96孔板中，100μL/孔；

B)室溫孵育30min，用PBS清洗96孔板3遍；

C)加入封閉液，100μL/孔；對照組血清、免疫組血清和標準血清分別加入至第一列，倍比稀釋至第10列，第11和12列分別加入16倍稀釋的標準陰性血清和標準陽性血清；

D)室溫孵育1h，洗96孔板3次；

E)以100μL/孔的量向其中加入以封閉液進行了1:2000(v:v)倍稀釋的HRP標記的抗豚鼠IgG，37℃孵育1小時；

F)洗液洗96孔板3次；

G)加入100μL/孔OPD底液，室溫孵育15min；

H)50μL/孔終止液終止反應；

I)492nm條件下測定OD值。

4.根據權利要求3所述的副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法，其特征在于所述比較待測的4型、5型二價滅活疫苗所免疫的血清抗體滴度與4型疫苗參照品、5型疫苗參照品所免疫的血清抗體滴度之間的數值關系，是分別計算待測的4型、5型二價滅活疫苗所免疫血清中4型抗體滴度與4型疫苗參照品所免疫血清中抗體滴度之間比值，以及待測的4型、5型二價滅活疫苗所免疫血清中5型抗體滴度與5型疫苗參照品所免疫血清中抗體滴度之間比值；上述兩個比值均大于或等于1時，檢驗結果為合格，否則檢驗結果為不合格。

5.根據權利要求4所述的副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法，其特征在于所述比較待測的4型、5型二價滅活疫苗所免疫的血清抗體滴度與4型疫苗參照品、5型疫苗參照品所免疫的血清抗體滴度之間的數值關系，是利用版本號為4.0的Rel Pot軟件實現的，在此過程中，滿足以下條件：標準陰性血清OD值小于0.1，標準陰性血清OD值與標準陽性血清OD值大于0.5；版本號為4.0的Rel Pot軟件中斜率大于0.8。

6.根據權利要求1所述的副豬嗜血桿菌病4型、5型二價滅活疫苗效力的檢驗方法，其特征在于步驟1)中，副豬嗜血桿菌4型單價滅活疫苗或副豬嗜血桿菌5型單價滅活疫苗是通過以下方法制備的：

α)培養副豬嗜血桿菌單血清型菌株，制備得到活菌液；

β)利用甲醛將步驟α)制備的活菌液進行滅活；

γ)采用離心而PBS溶液后重懸的方式將步驟β)滅活后菌液中菌體濃度調整至10⁹～10¹⁰CFU/mL，即得到抗原溶液；

δ)將步驟γ)所得抗原溶液與佐劑混合，即得到副豬嗜血桿菌單血清型滅活疫苗。