[發明專利]檢測抗血小板表面受體特異性自身抗體的試劑及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201710949437.3
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107727843A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 戴克勝
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/68
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司32103
• 代理人: 孫周強,陶海鋒

技術領域

本發明屬于檢測抗血小板表面受體特異性自身抗體檢測技術領域，具體涉及檢測抗血小板表面受體特異性自身抗體的試劑及其制備方法與應用，具有較高的特異性和敏感性。

背景技術

出血性疾病是臨床常見多發病，如若得不到快速診斷和及時干預可能會導致劇烈疼痛、臟器損傷甚至死亡。而全世界僅有約30%的出血性疾病患者得到了確診。免疫性血小板減少癥(immune thrommbocytopenic, ITP)是一種免疫介導的血小板減少綜合征，是臨床最常見的出血性疾病之一，可發生在各個年齡段，以女性多見。可分為急性和慢性兩種類型，成人常見為慢性，兒童以急性多見。臨床表現為皮膚多處瘀點、瘀斑，嚴重時出現顱內出血危及生命。該病的發病率為5～10/10萬人口，中國約有150萬患者。大部分ITP患者發病機制為患者體內存在抗血小板特異性抗體，抗體與血小板上抗原形成抗原抗體復合物，被免疫性系統識別，免疫細胞攻擊血小板導致其被清除。因此，血小板特異性抗體可能是導致血小板數目減少的重要原因。

現有的實驗室檢測血小板特異性抗體的方法有如下幾種，最早的方法是檢測ITP患者血清或血漿在體外對正常人血小板功能的影響，這種間接的檢測方法敏感性和特異性很低，且干擾因素較多，已淘汰。后來采用酶聯免疫法檢測血清中抗血小板抗體，該方法敏感性較高，陽性率可達到80-90%，但特異性較差，因該方法檢測的是抗血小板抗體，而非特異性吸附到血小板表面的免疫球蛋白。目前單克隆抗體特異性捕獲血小板抗原實驗（MAIPA）是檢測血小板特異性抗體的常用方法；但該方法存在敏感性低、操作繁瑣等不足。亟需研發一種操作簡便、特異性和敏感性均較高的檢測方法。

發明內容

本發明公開了一種檢測抗血小板表面受體特異性自身抗體的試劑及其制備方法，用于檢測血清或血漿中游離血小板表面受體特異性自身抗體，具有較高特異性和敏感性，且操作簡便，有效解決了現有雙抗夾心檢測法存在的敏感性低、操作繁瑣等不足。

本發明試劑盒包含表達人血小板特異性受體膜糖蛋白的細胞，這些細胞能夠結合血清中抗游離血小板表面受體特異性自身抗體，最后通過熒光標記的二抗顯色，即形成細胞-抗原-抗體-二抗復合物，并能夠在熒光顯微鏡及流式細胞儀上應用，從而聯合確定ITP（免疫性血小板減少）患者血清中游離的抗GP Ib-IX和/或GP IIb/IIIa抗體，結果可以明確診斷ITP患者亞類，指導用藥治療，也可以作為非疾病診斷指導人們健康生活。

本發明檢測用試劑具有較高的敏感性。研究表明，細胞表面表達的蛋白含量比傳統ELISA方法包被的抗原量高至少4倍，客觀上可以增加該檢測方法的敏感性。本發明檢測用試劑具有較高的特異性，經檢測53例健康獻血者以及102例ITP患者，ITP患者組熒光強度高于健康獻血者2-3倍，該試劑檢測抗GP Ib-IX抗體的敏感性為85.2%，特異性為90.4%；檢測抗GP IIb/IIIa抗體的敏感性為91.3%，特異性為95.2%；同時檢測抗GP Ib-IX和GP IIb/IIIa抗體的敏感性為86.3%，特異性為95.2%；聯合三種細胞同時檢測抗GP Ib-IX、GP IIb/IIIa、GP Ib-IX和/或GP IIb/IIIa抗體，與臨床符合率可達90%以上。用本試劑盒及檢測方法用血量少，只要0.5ml血清；操作簡便，不需要裂解血小板；用時較少，整個實驗過程需大約2小時；已報道的方法多數采用雙抗體夾心法檢測與血小板結合的自身抗體，即包被抗體捕獲裂解血小板的特異性抗原，若該抗原上結合了特異性自身抗體，則與二抗結合形成復合物，最后顯色被檢測，這種方法不能檢測血清中游離的抗血小板自身抗體，需要制備病人的血小板裂解液，操作繁瑣費時，本發明有效解決了這一缺陷。

為達到上述發明目的，本發明采用如下技術方案：

一種檢測抗血小板表面受體特異性自身抗體的試劑，包括表達人血小板特異性受體膜糖蛋白的細胞以及熒光素標記的抗體。

優選的，所述人血小板特異性受體膜糖蛋白包括GP Ib-IX和/或GP IIb/IIIa；所述細胞包括中國地鼠卵巢細胞；所述熒光素包括異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明或者藻紅蛋白；所述熒光素標記的抗體包括熒光素標記的羊抗人、鼠抗人、兔抗人免疫球蛋白多克隆抗體。

上述技術方案中，所述表達人血小板特異性受體膜糖蛋白的細胞的制備方法為，將編碼人血小板特異性受體膜糖蛋白的基因片段克隆進質粒載體得到重組質粒；然后將重組質粒轉染細胞，得到轉染細胞株；然后經過分選與培養得到表達人血小板特異性受體膜糖蛋白的細胞。