[發(fā)明專利]一種生物樣品中有機酸的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710949280.4
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107607666A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發(fā)明（設計）人: 馬振菁;林綏;闕慧卿;龍瑞斌;強小冰;陳姝彥;錢麗萍
• 申請（專利權）人: 福建省醫(yī)學科學研究院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發(fā)明屬于生物樣品有機酸分析領域，具體涉及一種生物樣品中有機酸的檢測方法。

背景技術

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學及蛋白質組學之后得到迅速發(fā)展的較新的研究領域，是生物系統(tǒng)中研究低分子量混合物具發(fā)展?jié)摿Φ姆治龇椒ǎ梢杂糜诜治錾飿悠分写x物水平的變化，是對限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分的定性和定量。脂肪酸氧化代謝組學即是分析血液中脂肪酸水平與尿液中有機酸水平。

氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)于1966年由K-Tanaka首先應用于遺傳代謝病檢測。目前國際上用于尿液預處理的方法主要有兩種，即有機酸萃取法和尿素酶法，前者主要應用于歐美國家，使用年限較長，后者是近幾年由日本學者建立并在亞洲國家推廣的一種相對年輕的方法。尿素酶法是應用濾紙收集尿標本，經尿素酶處理后，不經有機溶劑萃取直接進行GC-MS分析，但未經有機溶劑萃取的氣相色譜圖的雜峰甚多，不利結果分析，且甚易污染氣相色譜柱和質譜離子源。尿液有機酸萃取預處理法對各種特異性代謝產物的檢出量高于尿素酶預處理法，且對于后者無法檢測到的脂肪二羧酸有機酸經萃取預處理法仍能檢測出。在國內，羅小平等（2003年）和孫衛(wèi)華等（2008年）均采用乙酸乙酯和乙醚直接萃取尿液中有機酸，并以BSTFA-TMCS（99:1）作為衍生劑進行甲基硅烷化衍生；韓風等（2013年）將尿樣先采用尿素酶處理，除去尿素及蛋白質，再用乙酸乙酯和乙醚提取尿有機酸，而后用雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷混合物進行甲基硅烷化衍生。

基于質譜技術的不斷發(fā)展，國內對于有機酸衍生化這塊還局限于甲基硅烷化，而甲基硅烷化對反應樣品的要求是無水狀態(tài)，即樣品必須要氮氣吹干，這對提取的有機酸要求高，同時樣品經多次萃取增加了操作的復雜程度，也易造成損失。本發(fā)明在原先采用GC測定血液游離脂肪酸的基礎上，在一個體系里直接對有機酸/脂肪酸甲脂化后進行萃取，不僅減少了反復萃取可能造成的樣品損失，還能很好的滿足代謝物有機酸二羧酸類的檢測，而國內外尚未見由相關報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種生物樣品中有機酸的檢測方法，其不僅減少了反復萃取造成的樣品損失，還可減少有機溶劑的使用量，省去尿素酶及甲基硅烷化劑的使用，大大降低了成本，并可減輕廢液對環(huán)境的污染。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種生物樣品中有機酸的檢測方法，其包括以下步驟：

1）將晨尿或空腹血液于2200g離心8min，取上清液分裝于凍存管中，于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2）取所得上清液1mL于離心管中，加入100μL內標物十七烷酸，搖勻，再加入100μL質量濃度為2.5%的鹽酸羥胺和300μL、10mol/L的氫氧化鈉溶液，蓋緊，充分混勻后靜置1h，再加入130μL質量濃度為50%的硫酸酸化，最后加入2mL質量濃度為10%的硫酸甲醇溶液，漩渦振蕩1min后于60℃水浴鍋中甲酯化反應90min；

3）反應結束后將其取出，放至室溫，然后加入1mL超純水混勻，再加入2mL氯仿，漩渦振蕩2min后于2200g離心8min，得下層溶液；

4）所得下層溶液經0.45μm微孔有機濾膜過濾后置樣品瓶中，采用GC-MS進行檢測；其色譜條件為：Hp-5ms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣量：1μL；升溫程序：初始40℃保持3min，然后以8℃/min升溫至290℃，保持3min；以氦氣為載氣；流速為1.0mL/min；進樣口溫度：260℃，傳輸線：290℃；采用電子轟擊離子源質譜檢測，其電子能量70 eV；離子源溫度230℃；掃描范圍：m/z 50-550，掃描方式：全掃描和選擇離子掃描，溶劑延遲3.0min。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：

本發(fā)明可實現(xiàn)多種有機酸的同時檢測，且其不僅減少了反復萃取造成的樣品損失，還可減少有機溶劑的使用量，省去了尿素酶及甲基硅烷化劑的使用，大大降低了成本，并可減輕廢液對環(huán)境的污染。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內容更加便于理解，下面結合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

Agilent 7890A/5975C氣相色譜-質譜儀，配有電子轟擊離子源（EI）及化學工作站（美國Agilent公司）。

一種生物樣品中有機酸的檢測方法，其包括以下步驟：