[發(fā)明專利]一種測定外源dsRNA對瓢蟲毒性影響的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710949193.9
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107858405B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘慧鵬;楊春曉;邱寶利;吳建輝;桑文;王興民;金豐良
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

本發(fā)明公開了一種測定外源dsRNA對瓢蟲毒性影響的方法。具體是把外源dsRNA均勻混入蔗糖溶液后直接飼喂瓢蟲2～3天，而后用豌豆蚜飼喂；然后檢測分析目標(biāo)基因在瓢蟲中的表達(dá)量變化，并觀察瓢蟲的生物學(xué)變化，用以評價外源dsRNA對瓢蟲的毒性；所述瓢蟲包括異色瓢蟲、七星瓢蟲或十二星瓢蟲。該方法能夠有效測定外源dsRNA對異色瓢蟲、七星瓢蟲或十二星瓢蟲等瓢蟲的直接毒性影響，且方法簡單可行，有效性和靈敏性好，對相關(guān)基因的功能研究以及相關(guān)RNAi轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境風(fēng)險評價具有重要的意義和應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于昆蟲分子生物學(xué)研究技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種測定外源雙鏈RNA(dsRNA)對瓢蟲(異色瓢蟲、七星瓢蟲或十二星瓢蟲)毒性影響的方法，包括外源合成dsRNA或RNAi轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)的dsRNA對瓢蟲(異色瓢蟲、七星瓢蟲或十二星瓢蟲)毒性影響的測定方法。

背景技術(shù)

農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為第二次綠色革命的核心技術(shù)，快速的重塑了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的格局。1996年轉(zhuǎn)蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis(Bt)殺蟲蛋白基因的抗蟲作物開始商業(yè)化種植，到2015年種植Bt作物的國家已達(dá)28個，年種植面積近27億畝(http://www.isaaa.org/)。按轉(zhuǎn)基因作物的種植面積對種植轉(zhuǎn)基因作物的國家進(jìn)行排序，中國列在美國、巴西、阿根廷、印度和加拿大之后，排第6位。2016年中央1號文件強(qiáng)調(diào)，要“加強(qiáng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)和監(jiān)管，在確保安全的基礎(chǔ)上慎重推廣”。2016年8月8日印發(fā)的“十三五”國家科技創(chuàng)新規(guī)劃明確，包括轉(zhuǎn)基因在內(nèi)的一系列國家重大科技專項(xiàng)將加快實(shí)施，核心關(guān)鍵技術(shù)要在“十三五”期間持續(xù)攻克，推進(jìn)新型轉(zhuǎn)基因抗蟲棉、抗蟲玉米等重大產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。所以，未來我國轉(zhuǎn)基因作物的種植面積會進(jìn)一步加大。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指物種在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象(Fire etal.1998)。近20年來，RNAi的技術(shù)和產(chǎn)品快速發(fā)展，在科學(xué)界、工業(yè)界以及社會公眾中受到了前所未有的關(guān)注。在農(nóng)業(yè)方面，RNAi被認(rèn)為是具有應(yīng)用潛力的害蟲防治新方法(Gordonand Waterhouse,2007；Huvenne and Smagghe,2010)。基于RNAi技術(shù)的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)被證明是可以有效控制鱗翅目、鞘翅目以及半翅目害蟲的方法，如玉米根葉甲Diabrotica virgifera virgifera(Baum et al.2007)；馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata(Zhang et al.2015)；棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Mao etal.2007)；亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Wu et al.2016)；煙粉虱Bemisia tabaci(Thakur et al.2014；Shukla et al.2016)；桃蚜Myzuspersicae(Guo et al.2014)；麥二叉蚜Schizaphis graminum(Zhang et al.2015)；麥長管蚜Sitobion avenae(Xu etal.2014)；褐飛虱Nilaparvata lugens(Zha et al.2011)等。具有良好抗蟲性狀的RNAi轉(zhuǎn)基因作物已研制成功，預(yù)示著其商業(yè)化應(yīng)用成為可能。雖然當(dāng)前Bt作物防治鱗翅目和鞘翅目害蟲仍然有效(Wu et al.2008；Tabashnik et al.2008)，但Bt作物對近年來持續(xù)暴發(fā)為害的刺吸式口器害蟲如蚜蟲、葉蟬、飛虱及粉虱等無效。所以，發(fā)展RNAi轉(zhuǎn)基因作物將為包括這類害蟲在內(nèi)的防控提供新途徑(Price and Gatehouse,2008)，也可為防治鱗翅目和鞘翅目害蟲的Bt作物提供重要的輪換。