[發明專利]跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒及其構建方法

在審

• 申請號: 201710949086.6
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107574182A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發明（設計）人: 童德文;黃勇;李德龍
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司61200
• 代理人: 范巍

技術領域

本發明屬于基因工程疫苗領域，具體涉及跨膜型豬圓環病毒2型(PCV2)重組腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的構建。

背景技術

腺病毒具有致病力低、宿主范圍廣、穩定性好、易進行重組DNA操作、病毒滴度高、易于濃縮和貯存以及能容納較大基因片段等優點，而且其生物學背景已研究得相當清楚，因而腺病毒載體在疫苗制備、癌癥、傳染病和遺傳病的基因治療等方面被廣泛研究和應用，被認為是最有前途的載體之一。

腺病毒作為一種常用的疫苗載體，其最大的問題是腺病毒自身蛋白可以誘導宿主產生強烈的免疫應答反應，從而限制了這種疫苗在臨床實踐中的應用。

降低腺病毒自身免疫反應的方法之一是提高目的蛋白的表達量，從而降低腺病毒免疫劑量，進而降低腺病毒自身免疫反應。人巨細胞病毒第一內含子Intron A作為轉錄調節元件，與hCMV啟動子/增強子一同提高缺失內含子的目的基因的表達。內含子可能通過幾種不同機制來提高基因表達效率，這些機制通常分為兩類：一類是保護機制；另一類是增強機制。保護機制強調內含子的保護能力，認為內含子的某些序列能夠通過自身折疊或者結合其他蛋白形成一種二級結構從而達到穩定初級轉錄本的目的。另外內含子序列還可以作為RNA保護因子的靶序列來穩定初級轉錄本，間接增加了mRNA在核內的穩定性，導致細胞質中積累更多的成熟mRNA，進而增強目的基因的表達效率。增強機制則強調內含子的促轉錄能力。某些內含子有這樣一些序列，能夠起到類似增強子或其他順式調控元件的功能，它們同某些蛋白質結合從而影響其轉錄的起始和延伸，開放染色體的功能域。另一個調控基因表達的元件是土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節元件WPRE，主要作用是增加mRNA的穩定性、3'端的加工、促進mRNA出核以及胞質中mRNA的積累，從而增強未經剪接的目的基因表達量。

另一個方法是增強腺病毒載體疫苗的免疫效果，常用方法是引入細胞因子作為分子佐劑以增強疫苗免疫效果。CD40L是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成員之一，CD40是其受體。CD40-CD40L交聯不僅在體液免疫中扮演重要角色，而且在調節細胞介導的免疫應答中也發揮重要的作用。一方面CD40-CD40L交聯對B細胞的活化、增殖，抗體的產生以及Ig類別轉換，起了非常重要的作用。另一方面CD40-CD40L交聯可促進CD4⁺T細胞自身被活化，表達CD25、CD40L增高，促進IL-12的跨膜，而后者參與CTL的產生以及誘導T細胞向Th l細胞分化。另一個細胞因子是GMCSF，其不僅能刺激造血祖細胞增殖、分化和成熟，而且還能活化中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cells,DC)及其他單核細胞，在細胞因子網絡中占有重要地位。GMCSF能夠誘導造血前體細胞分化增殖，維持造血前體細胞和成熟血細胞的存活，增強DC的活性和生物學功能，促進皮膚中朗罕氏細胞的增殖分化，吸引DC向注射部位集聚和成熟，并提高其抗原遞呈能力，從而起到增強疫苗免疫效果的作用。

豬圓環病毒相關性疾病(porcine circovirus associated disease，PCVAD)是豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)引起的流行非常廣泛的豬傳染性疾病。1991年加拿大首次暴發該病，隨后許多國家報道了該病，PCVAD已經給養豬業造成巨大經濟損失。PCV2重組腺病毒載體疫苗已經有人進行過相關研究，例如未修飾的PCV2重組腺病毒載體疫苗Ad-Cap，但是還沒有相應的商品化PCV2重組腺病毒載體疫苗應用于臨床實踐。分析原因得出：腺病毒載體自身蛋白可以誘導機體產生強烈的免疫應答反應，嚴重影響機體針對目的蛋白免疫應答反應。

發明內容

本發明的目的在于提供一種跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒及其構建方法。

為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒穿梭載體，該重組腺病毒穿梭載體為插入有目的基因片段的腺病毒穿梭質粒，所述目的基因片段包括蛋白編碼區以及增強表達元件，所述增強表達元件包括人巨細胞病毒第一內含子Intron A以及土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件WPRE，所述蛋白編碼區包括帶有分泌信號肽sp的腫瘤壞死因子相關激活蛋白CD40L(分泌型CD40L)序列、帶有跨膜信號肽tp的豬圓環病毒2型衣殼蛋白Cap(跨膜型PCV2Cap)序列以及帶有分泌信號肽sp的粒細胞-巨細胞集落刺激因子GMCSF(分泌型GMCSF)序列，所述CD40L、Cap以及GMCSF為共表達。