[發明專利]跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒及其構建方法

在審

• 申請號: 201710949086.6
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107574182A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發明（設計）人: 童德文;黃勇;李德龍
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司61200
• 代理人: 范巍

1.一種跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒穿梭載體，其特征在于：該重組腺病毒穿梭載體為插入有目的基因片段的腺病毒穿梭質粒，所述目的基因片段包括蛋白編碼區以及增強表達元件，所述增強表達元件包括人巨細胞病毒第一內含子Intron A以及土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件WPRE，所述蛋白編碼區包括帶有分泌信號肽sp的腫瘤壞死因子相關激活蛋白CD40L序列、帶有跨膜信號肽tp的豬圓環病毒2型衣殼蛋白Cap序列以及帶有分泌信號肽sp的粒細胞-巨細胞集落刺激因子GMCSF序列，所述CD40L、Cap以及GMCSF為共表達。

2.根據權利要求1所述一種跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒穿梭載體，其特征在于：所述蛋白編碼區還包括設置在所述CD40L、Cap以及GMCSF序列兩兩之間的自剪切2A肽的序列。

3.根據權利要求1所述一種跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒穿梭載體，其特征在于：所述重組腺病毒穿梭載體具體包括依次排列的啟動子、目的基因片段、polyA尾以及兩個同源臂序列。

4.一種如權利要求1所述的跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒穿梭載體的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)構建目的基因片段

1.1)將所述CD40L序列、所述Cap序列、所述GMCSF序列三個片段，利用重疊PCR進行連接，得到中間片段，且其中任意兩個片段之間插入有自剪切2A肽的序列；

1.2)將所述中間片段與Intron A及WPRE連接，得到目的基因片段；

2)將目的基因片段克隆至腺病毒穿梭質粒。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：所述步驟1.1)具體包括以下步驟：

1.1.1)以pS-CD40L-Cap-GMCSF質粒為擴增模板，通過引物P1和P2、P3和P4及P7和P8分別擴增得到包含有所述CD40L序列的sp-CD40L-2A-tp片段、包含有所述Cap序列的tp-Cap-2A-sp片段及包含有所述GMCSF序列的sp-GMCSF片段；P1的序列如SEQ.ID.NO.1所示，P2的序列如SEQ.ID.NO.2所示，P3的序列如SEQ.ID.NO.3所示，P4的序列如SEQ.ID.NO.4所示，P7的序列如SEQ.ID.NO.7所示，P8的序列如SEQ.ID.NO.8所示；

1.1.2)將sp-CD40L-2A-tp片段及tp-Cap-2A-sp片段通過引物P5和P6進行重疊PCR，得到sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp片段，然后將sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp片段及sp-GM CSF片段通過引物P5和P8進行重疊PCR，得到中間片段sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF；P5的序列如SEQ.ID.NO.5所示，P6的序列如SEQ.ID.NO.6所示。

6.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：所述步驟1.2)具體包括以下步驟：將puc-Intron A-Cap-WPRE質粒中的Cap序列用所述中間片段替換，得到擴增模板，然后通過引物P9和P10擴增得到目的基因片段；P9的序列如SEQ.ID.NO.9所示，P10的序列如SEQ.ID.NO.10所示。

7.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：所述步驟2)具體包括以下步驟：將目的基因片段插入至腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV的多克隆位點。

8.一種跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒，其特征在于：所述重組腺病毒是利用重組腺病毒質粒進行腺病毒包裝而得到的，所述重組腺病毒質粒由跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒穿梭載體與腺病毒骨架載體同源重組形成；該重組腺病毒穿梭載體為插入有目的基因片段的腺病毒穿梭質粒，所述目的基因片段包括蛋白編碼區以及增強表達元件，所述增強表達元件包括人巨細胞病毒第一內含子Intron A以及土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件WPRE，所述蛋白編碼區包括帶有分泌信號肽sp的腫瘤壞死因子相關激活蛋白CD40L序列、帶有跨膜信號肽tp的豬圓環病毒2型衣殼蛋白Cap序列以及帶有分泌信號肽sp的粒細胞-巨細胞集落刺激因子GMCSF序列，所述CD40L、Cap以及GMCSF為共表達。

9.根據權利要求8所述一種跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒，其特征在于：所述重組腺病毒質粒的序列如SEQ.ID.NO.11所示。

10.如權利要求1所述的跨膜型豬圓環病毒2型重組腺病毒穿梭載體在制備豬圓環病毒2型基因工程疫苗中的用途。