[發(fā)明專利]用于rLj?RGD3免疫原性檢測(cè)的ELISA試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710948724.2
• 申請(qǐng)日: 2017-10-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107703309A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王繼紅;呂莉;王玉平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遼寧師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所21220
• 代理人: 閃紅霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種ELISA試劑盒，尤其是一種用于rLj-RGD3免疫原性檢測(cè)的ELISA試劑盒。

背景技術(shù)

Lj-RGD3為來(lái)源于日本七鰓鰻口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由117個(gè)氨基酸殘基組成，Lj-RGD3的一級(jí)結(jié)構(gòu)除具有三個(gè)RGD 模體和一對(duì)半胱氨酸這一典型的RGD毒素蛋白特征外，還含有17個(gè)組氨酸，17個(gè)精氨酸，是一類HRG的堿性蛋白，其序列已公開(kāi)于專利號(hào)為200510083437.7、名稱為“具抗腫瘤作用的日本七鰓鰻口腔腺RGD模體蛋白的基因克隆與表達(dá)”的中國(guó)發(fā)明專利文獻(xiàn)中，即命名為L(zhǎng)ampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗腫瘤增殖、抗血栓等功效。

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒）是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)，其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體在固相表面進(jìn)行反應(yīng)，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，通過(guò)底物顯色，讀取OD₄₅₀，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定所檢測(cè)的抗原或抗體含量。常用的 ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）法有雙抗體夾心法和橋接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定多克隆抗體，故后者常用于免疫原性檢測(cè)，即檢測(cè)抗原能夠刺激機(jī)體形成特異抗體的能力，一般免疫原性檢測(cè)時(shí)要求抗原蛋白含量大于5.0mg，蛋白純度高于85%。雖然市場(chǎng)上有大量檢測(cè)不同抗原或抗體的試劑盒有售，但目前受制備rLj-RGD3的得率及純度影響，尚沒(méi)有專用于rLj-RGD3免疫原性檢測(cè)的方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種用于rLj-RGD3免疫原性檢測(cè)的ELISA試劑盒。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種用于rLj-RGD3免疫原性檢測(cè)的ELISA試劑盒，有吸附在固相載體上的抗原及標(biāo)準(zhǔn)曲線板，其特征在于：

所述抗原依次按照如下步驟制備：

（1）將rLj-RGD3重組表達(dá)菌BL21培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；

（2）進(jìn)行終濃度為1 mM的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度30 ℃；

（3）10000 g 離心10 min收集菌體，棄上清，以每100 ml的菌體加4 ml 冰冷的1 X Binding buffer重懸細(xì)胞；

（4）置于冰上超聲裂解細(xì)胞，直至溶液不再粘稠；

（5）14000 g 離心20 min取上清，棄沉淀；

（6）上清用0.45 μm的一次性除菌濾器過(guò)濾；

（7）His.Bind Column純化：吸去His.Bind Column上室的貯液并打開(kāi)下面管口；用10 ml的1x Binding Buffer對(duì)柱子進(jìn)行平衡；上樣；用10 ml的1x Binding Buffer洗柱；用10 ml的1x Wash Buffer洗柱；用5 ml的1x Elute Buffer洗脫目的蛋白；得rLj-RGD3蛋白為抗原；

所述標(biāo)準(zhǔn)曲線依次按照如下方法制備：

（1）用所得rLj-RGD3蛋白免疫兩只實(shí)驗(yàn)兔：免疫前血清采集→每只兔采用50~200 μg rLj-RGD3與完全佐劑混合進(jìn)行首次免疫→第14日采用每兔50~200 μg rLj-RGD3與不完全佐劑混合進(jìn)行第二次免疫并于第21天采血進(jìn)行效價(jià)測(cè)定→第35日采用每兔50~200 μg rLj-RGD3與不完全佐劑混合進(jìn)行第三次免疫并于第45天采血進(jìn)行效價(jià)測(cè)定→第56日以每兔50~200 μg rLj-RGD3與PBS混合進(jìn)行第四次免疫→于第70日將動(dòng)物進(jìn)行安樂(lè)死收集血清；

（2）血清用PBS等體積稀釋，5000~10000 rpm離心15分鐘，取上清→用10倍體積的PBS清洗親和柱以平衡柱子→將稀釋好的上清加入平衡好的柱子中，室溫下混合搖動(dòng)2~4小時(shí)或4 ℃過(guò)夜→用10倍體積的PBS清洗親和柱→用2倍體積的抗體洗脫液洗滌柱子，以得到rLj-RGD3多克隆抗體；

（3）用辣根過(guò)氧化物酶對(duì)rLj-RGD3蛋白進(jìn)行標(biāo)記；

（4）在酶標(biāo)板上以每孔50 μl的rLj-RGD3抗原蛋白鋪板，并于室溫孵育1~2 h 或4 ℃過(guò)夜；

（5）室溫下用封閉液封閉至少30 min；

（6）移除封閉液并洗板；