[發明專利]用于rLj?RGD3免疫原性檢測的ELISA試劑盒

在審

• 申請號: 201710948724.2
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107703309A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 王繼紅;呂莉;王玉平
• 申請（專利權）人: 遼寧師范大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 大連非凡專利事務所21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種用于rLj-RGD3免疫原性檢測的ELISA試劑盒，有吸附在固相載體上的抗原及抗體標準曲線，其特征在于：

所述抗原依次按照如下步驟制備：

（1）將rLj-RGD3重組表達菌BL21培養至對數生長期；

（2）進行終濃度為1 mM的IPTG誘導，誘導溫度30 ℃；

（3）10000 g 離心10 min收集菌體，棄上清，以每100 ml的菌體加4 ml 冰冷的1 X Binding buffer重懸細胞；

（4）置于冰上超聲裂解細胞，直至溶液不再粘稠；

（5）14000 g 離心20 min取上清，棄沉淀；

（6）上清用0.45 μm的一次性除菌濾器過濾；

（7）His.Bind Column純化：吸去His.Bind Column上室的貯液并打開下面管口；用10 ml的1x Binding Buffer對柱子進行平衡；上樣；用10 ml的1x Binding Buffer洗柱；用10 ml的1x Wash Buffer洗柱；用5 ml的1x Elute Buffer洗脫目的蛋白；得rLj-RGD3蛋白為抗原；

所述標準曲線依次按照如下方法制備：

（1）用所得rLj-RGD3蛋白免疫兩只實驗兔：免疫前血清采集→每只兔采用50~200 μg rLj-RGD3與完全佐劑混合進行首次免疫→第14日采用每兔50~200 μg rLj-RGD3與不完全佐劑混合進行第二次免疫并于第21天采血進行效價測定→第35日采用每兔50~200 μg rLj-RGD3與不完全佐劑混合進行第三次免疫并于第45天采血進行效價測定→第56日以每兔50~200 μg rLj-RGD3與PBS混合進行第四次免疫→于第70日將動物進行安樂死收集血清；

（2）血清用PBS等體積稀釋，5000~10000 rpm離心15分鐘，取上清→用10倍體積的PBS清洗親和柱以平衡柱子→將稀釋好的上清加入平衡好的柱子中，室溫下混合搖動2~4小時或4 ℃過夜→用10倍體積的PBS清洗親和柱→用2倍體積的抗體洗脫液洗滌柱子，以得到rLj-RGD3多克隆抗體；

（3）用辣根過氧化物酶對rLj-RGD3蛋白進行標記；

（4）在酶標板上以每孔50 μl的rLj-RGD3抗原蛋白鋪板，并于室溫孵育1~2 h 或4 ℃過夜；

（5）室溫下用封閉液封閉至少30 min；

（6）移除封閉液并洗板；

（7）向包被rLj-RGD3蛋白的相應微孔板中分別加入500ng/ml、750 ng/ml、1000 ng/ml、2000 ng/ml、3000 ng/ml、4000 ng/ml梯度濃度的rLj-RGD3多克隆抗體100 μl/孔→25±2 ℃ 孵育60 分鐘→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入辣根過氧化物酶標記的rLj-RGD3蛋白100 μl/孔，25±2 ℃ 孵育60分鐘，形成rLj-RGD3蛋白- 抗體-rLj-RGD3-HRP 復合物→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入TMB 顯色液100 μl/孔→25±2 ℃ 孵育15 分鐘→每孔加入終止液50 μl；

（8）讀取不同濃度rLj-RGD3多克隆抗體對應的OD₄₅₀值，繪制標準曲線。