[發(fā)明專利]一種檢測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3′-5′外切活性的方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710948000.8
• 申請(qǐng)日: 2017-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN109652501B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李長(zhǎng)英;章文蔚;陳奧;徐崇鈞;龔梅花;王靜靜;羅銀玲;羅宇芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6816
• 分類號(hào): C12Q1/6816;C12Q1/34
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;白艷

本發(fā)明公開了一種檢測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'?5'外切活性的方法和試劑盒。本發(fā)明首次提出檢測(cè)酶對(duì)特定堿基的外切活性；利用該發(fā)明可以檢測(cè)任一堿基，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP以及簡(jiǎn)并堿基等，應(yīng)用范圍十分廣泛；該發(fā)明可以檢測(cè)大多數(shù)核酸酶的3’?5’外切活性；使用熒光作為檢測(cè)信號(hào)，避免了放射性污染，且靈敏度高；無需熒光基團(tuán)修飾的核苷酸鏈，成本低；可以用來快速大量地篩選核酸酶，應(yīng)用靈活，通量高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切活性的方法和試劑盒。

背景技術(shù)

很多核酸酶具有3’-5’的外切活性。檢測(cè)核酸酶3’-5’外切活性對(duì)于了解 DNA聚合酶的校正能力、DNA外切酶的降解速率等具有重要意義。核酸酶對(duì)不同堿基(包括各種修飾堿基、簡(jiǎn)并堿基等)的外切能力不同，對(duì)堿基在正確配對(duì)和不同形式的錯(cuò)誤配對(duì)情況下的外切能力也不同。研究核酸酶對(duì)某一特定堿基的外切活性對(duì)分子生物學(xué)研究和藥物研發(fā)等均有重要意義。

現(xiàn)有的檢測(cè)3’-5’外切酶活性的技術(shù)多是需要放射性標(biāo)記、凝膠電泳、酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)或者合成帶熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針等，操作復(fù)雜、成本高而且易污染。同時(shí)現(xiàn)有的技術(shù)不能檢測(cè)核酸酶針對(duì)任一特定堿基的外切活性。

利用放射性同位素檢測(cè)核酸酶3’-5’外切活性是常用的方法。通過合成一條 3'末端帶³H標(biāo)記核苷酸的寡核苷酸鏈，利用核酸酶3'-5'外切活性切除該放射性同位素標(biāo)記的堿基，然后經(jīng)過一系列復(fù)雜的沉淀、過濾等步驟，最后通過測(cè)定放射性的含量計(jì)算3'-5'外切酶活性。

有研究人員(專利CN104293930 A，一種3'-5'外切酶活性測(cè)定方法)將3'端有錯(cuò)配堿基的引物與單鏈模板混合并退火，加入酶進(jìn)行3'堿基外切反應(yīng)，然后加入足量沒有3'-5'外切酶活性的聚合酶延長(zhǎng)引物直至獲得雙鏈DNA，通過檢測(cè)反應(yīng)體系中雙鏈DNA的相對(duì)量來推導(dǎo)出外切酶活性程度。

有研究人員(專利CN104293917 B，用于具有3’-5’外切活性的核酸酶檢測(cè)的硫代探針)通過發(fā)明一種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針來檢測(cè)核酸酶的3’-5’外切活性。該探針環(huán)部是單鏈結(jié)構(gòu)，頸部則是雙鏈結(jié)構(gòu)，每?jī)蓚€(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵全部硫?；挥?’末端的堿基不硫酰化，同時(shí)3’末端堿基鏈接有熒光基團(tuán)，3’-5’的第四個(gè)堿基上含有淬滅基團(tuán)。在沒有目標(biāo)酶存在時(shí)熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)靠近，沒有熒光信號(hào)，當(dāng)酶切除了3’端堿基之后熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，熒光信號(hào)恢復(fù)。通過檢測(cè)熒光信號(hào)來檢測(cè)酶的外切活性。

放射性同位素法易產(chǎn)生污染，且操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化。專利CN104293930 A中對(duì)于外切活性特別高的或者特別低的酶檢測(cè)結(jié)果不能十分準(zhǔn)確，所以具有一定的局限性，同時(shí)也不能準(zhǔn)確地檢測(cè)出核酸酶對(duì)某一個(gè)特定堿基的外切活性。專利CN104293917 B需要合成有莖環(huán)結(jié)構(gòu)且?guī)в写銣缁鶊F(tuán)和熒光基團(tuán)的探針，成本高，同樣無法檢測(cè)核酸酶對(duì)某一個(gè)特定堿基的外切活性，尤其是由于3’端最后一個(gè)堿基帶有熒光基團(tuán)，限制了所能檢測(cè)的修飾堿基的范圍。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)不同的待測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切活性的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)根據(jù)含有已知序列的單鏈DNA分子設(shè)計(jì)合成與所述已知序列互補(bǔ)的引物；該引物中按照5’-3’的順序倒數(shù)第二個(gè)堿基和倒數(shù)第三個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵作防止外切酶外切修飾，5’端堿基用防止外切酶外切修飾，3’端最后一個(gè)堿基為特定堿基；

所述含有已知序列的單鏈DNA分子上設(shè)有堿基甲和堿基乙；所述堿基甲為所述已知序列中與所述特定堿基對(duì)應(yīng)配對(duì)的堿基；所述堿基乙為所述已知序列中從 5’端起所述堿基甲上游緊鄰的第一個(gè)堿基；所述堿基甲和所述堿基乙不同；

2)將固定在固定相上的所述含有已知序列的單鏈DNA分子與所述引物雜交，再用不同的待測(cè)核酸酶酶切雜交的產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物；