[發(fā)明專利]一種檢測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3′-5′外切活性的方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710948000.8
• 申請(qǐng)日: 2017-10-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109652501B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李長(zhǎng)英;章文蔚;陳奧;徐崇鈞;龔梅花;王靜靜;羅銀玲;羅宇芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6816
• 分類號(hào): C12Q1/6816;C12Q1/34
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;白艷

1.一種檢測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切活性的方法，包括如下步驟：

1）根據(jù)含有已知序列的單鏈DNA分子設(shè)計(jì)合成與所述已知序列互補(bǔ)的引物；該引物中按照5’-3’的順序倒數(shù)第二個(gè)堿基和倒數(shù)第三個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵作防止外切酶外切修飾，5’端堿基用防止外切酶外切修飾，3’端最后一個(gè)堿基為特定堿基；

所述含有已知序列的單鏈DNA分子上設(shè)有堿基甲和堿基乙；所述堿基甲為所述已知序列中與所述引物中特定堿基對(duì)應(yīng)配對(duì)的堿基；所述堿基乙為所述已知序列中從5’端起所述堿基甲上游緊鄰的第一個(gè)堿基；所述堿基甲和所述堿基乙不同；

2）將固定在固相上的所述含有已知序列的單鏈DNA分子與所述引物雜交，再用不同的待測(cè)核酸酶酶切雜交的產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物；

3）向所述酶切產(chǎn)物中引入DNA聚合酶和熒光修飾目標(biāo)dNTP,聚合反應(yīng)，根據(jù)聚合反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)判斷所述不同的待測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切活性；

所述熒光修飾目標(biāo)dNTP與所述堿基甲或所述堿基乙互補(bǔ)；

所述固定在固相上的含有已知序列的單鏈DNA分子的裸露端堿基進(jìn)行防止外切酶外切修飾；

所述根據(jù)聚合反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)判斷所述不同的待測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切活性為如下：

當(dāng)所述熒光修飾目標(biāo)dNTP與所述堿基甲互補(bǔ)時(shí)，比較所述不同的待測(cè)核酸酶中任2個(gè)待測(cè)核酸酶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，熒光信號(hào)強(qiáng)的待測(cè)核酸酶的對(duì)特定堿基3'-5'外切活性大于熒光信號(hào)弱的待測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切活性；

或當(dāng)所述熒光修飾目標(biāo)dNTP與所述堿基乙互補(bǔ)時(shí)，比較所述不同待測(cè)的核酸酶中任2個(gè)待測(cè)核酸酶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，熒光信號(hào)弱的待測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切活性大于熒光信號(hào)強(qiáng)的待測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切活性；

所述含有已知序列的單鏈DNA分子上還設(shè)有堿基丙；

所述堿基丙為所述已知序列中從5’端起所述堿基甲上游緊鄰的第二個(gè)堿基；

所述堿基乙與所述堿基丙相同或不同；

若所述堿基乙與所述堿基丙相同，則所述熒光修飾目標(biāo)dNTP的糖環(huán)上3’羥基做阻斷修飾。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

所述特定堿基為可切除的堿基；

或所述特定堿基為可切除的堿基，所述可切除的堿基具體為天然堿基、簡(jiǎn)并堿基、正確堿基、錯(cuò)配堿基或非防止外切酶外切修飾的修飾堿基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

針對(duì)堿基的所述防止外切酶外切修飾為磷酸化修飾、硫代修飾或其他防止外切的修飾方式；

針對(duì)磷酸二酯鍵的所述防止外切酶外切修飾為硫酰化或甲基化修飾。

4.一種定量檢測(cè)待測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切酶活的方法，包括如下步驟：以已知酶活性的內(nèi)參核酸酶作為對(duì)照，按照權(quán)利要求1-3中任一所述的方法的步驟1）-3）分別檢測(cè)所述已知酶活性的內(nèi)參核酸酶的熒光強(qiáng)度和所述待測(cè)核酸酶熒光強(qiáng)度；再通過(guò)計(jì)算該待測(cè)核酸酶熒光強(qiáng)度與所述內(nèi)參核酸酶的熒光強(qiáng)度的比值，得到該待測(cè)核酸酶的對(duì)特定堿基3'-5'外切酶活。

5.一種檢測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切酶活的試劑盒，包括權(quán)利要求1-3任一所述方法中的所述含有已知序列的單鏈DNA分子、所述引物、 所述DNA聚合酶和所述熒光修飾目標(biāo)dNTP。

6.權(quán)利要求5所述的試劑盒在檢測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切活性中的應(yīng)用；

或權(quán)利要求5所述的試劑盒在定量檢測(cè)核酸酶對(duì)特定堿基3'-5'外切酶活大小中的應(yīng)用。