[發(fā)明專利]快速檢測和篩選能聚合特殊構(gòu)造dNTP的DNA聚合酶的方法

有效

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• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN109652500B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王靜靜;章文蔚;陳奧;徐崇鈞;龔梅花;羅銀玲;羅宇芬;李長英
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/48
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;白艷

本發(fā)明公開了快速檢測和篩選能聚合特殊構(gòu)造dNTP的DNA聚合酶的方法。本發(fā)明提供了種檢測待測DNA聚合酶能否聚合特定結(jié)構(gòu)dNTP的方法，包括如下步驟：1)制備一段單鏈DNA分子和與其互補(bǔ)的雜交單鏈；所述單鏈DNA分子中從5‘至3’方向上包括依次排列的相鄰的堿基乙和堿基甲；2)將所述單鏈DNA分子、所述雜交單鏈、所述特定結(jié)構(gòu)dNTP和待測DNA聚合酶放在體系里進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)，檢測是否能成功聚合。本發(fā)明的檢測方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：適用范圍廣、無污染、可行性、通量靈活，高通量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速檢測和篩選能聚合特殊構(gòu)造dNTP的DNA聚合酶的方法。

背景技術(shù)

隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，所使用的dNTP結(jié)構(gòu)被不斷的改造：邊合成邊測序技術(shù)使用的dNTP的3'-OH被可切除的阻斷基團(tuán)封閉，且堿基上還加入了一個可切除的熒光基團(tuán)；PacBio的單分子測序使用的dNTP是3'-OH自由但5'-磷酸基團(tuán)修飾有熒光基團(tuán)；還有些新型的dNTP分子在繼續(xù)被開發(fā)和應(yīng)用于測序技術(shù)中。這些都要求DNA聚合酶也需進(jìn)行相應(yīng)的改變才能繼續(xù)行使聚合功能。實(shí)際上，DNA聚合酶已經(jīng)是測序技術(shù)中的一個決定性的因素。因此針對不同種類的特殊構(gòu)造dNTP,需要開發(fā)出一種快速簡單的從大量的突變體中篩選出合適的DNA聚合酶的方法。

現(xiàn)有技術(shù)主要用于檢測或篩選對自然dNTP進(jìn)行聚合的DNA聚合酶，而對應(yīng)用于測序技術(shù)中的結(jié)構(gòu)特殊的dNTP的應(yīng)用非常有限，只能用于能聚合3'-羥基自由且沒有熒光標(biāo)記的dNTP的DNA聚合酶的篩選，不能用于聚合3'-羥基連接有修飾基團(tuán)或有熒光標(biāo)記dNTP的DNA聚合酶的篩選，因?yàn)?'-羥基不自由的dNTP不能被連續(xù)的聚合產(chǎn)生可被檢測的雙鏈DNA，而有熒光標(biāo)記的dNTP會影響picogreen染料與底物結(jié)合產(chǎn)生的熒光，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

由于特殊構(gòu)造的dNTP是隨著測序技術(shù)的發(fā)展而快速發(fā)展和應(yīng)用的,目前對可用于聚合特殊構(gòu)造的dNTP的DNA聚合酶的篩選方法并不完善。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測待測DNA聚合酶能否聚合特定結(jié)構(gòu)dNTP的方法，包括如下步驟：

1)制備一段單鏈DNA分子和與其互補(bǔ)的雜交單鏈；

所述單鏈DNA分子中從5‘至3’方向上包括依次排列的相鄰的堿基乙和堿基甲，所述雜交單鏈與所述單鏈DNA分子互補(bǔ)時還需滿足如下條件：所述雜交單鏈3'末端的核苷酸與所述單鏈DNA分子上的堿基甲互補(bǔ)，所述堿基乙與待聚合特定結(jié)構(gòu)dNTP互補(bǔ)；

2)將所述單鏈DNA分子、所述雜交單鏈、所述特定結(jié)構(gòu)dNTP和待測DNA聚合酶放在體系里進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)，并且以所述單鏈DNA分子作為延伸模板，檢測是否能成功聚合，若能成功聚合，則待測DNA聚合酶能聚合特定結(jié)構(gòu)dNTP，若不能成功聚合，則待測DNA聚合酶不能聚合特定結(jié)構(gòu)dNTP。

上述特定結(jié)構(gòu)dNTP為熒光修飾dNTP、無熒光修飾且3’端阻斷dNTP或無熒光修飾且3’端自由dNTP；

上述方法中，所述檢測是否能成功聚合的方法如下：

(1)當(dāng)所述特定結(jié)構(gòu)dNTP為熒光修飾dNTP，若聚合反應(yīng)有熒光信號，則所述待測DNA聚合酶能聚合所述熒光修飾dNTP；

若聚合反應(yīng)無熒光信號，則所述待測DNA聚合酶不能聚合所述熒光修飾dNTP；

所述聚合反應(yīng)的信號越強(qiáng)，說明待測DNA聚合酶對熒光修飾dNTP的聚合能力越強(qiáng)。

(2)當(dāng)所述特定結(jié)構(gòu)dNTP為無熒光修飾且3’端自由dNTP，向聚合反應(yīng)后的體系中加入帶有熒光的另一dNTP和已知能聚合所述另一dNTP且無外切活性的聚合酶，進(jìn)行二次聚合反應(yīng)，檢測二次聚合反應(yīng)的熒光信號，若二次聚合反應(yīng)有熒光信號，則所述待測DNA聚合酶能聚合該所述無熒光修飾且3’端自由dNTP；