[發明專利]快速檢測和篩選能聚合特殊構造dNTP的DNA聚合酶的方法

有效

• 申請號: 201710947998.X
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN109652500B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 王靜靜;章文蔚;陳奧;徐崇鈞;龔梅花;羅銀玲;羅宇芬;李長英
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/48
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

1.一種檢測待測DNA聚合酶能否聚合特定結構dNTP的方法，包括如下步驟：

1）制備一段單鏈DNA分子和與其互補的雜交單鏈；

所述單鏈DNA分子中從5‘至3’方向上包括相鄰排列的堿基乙和堿基甲，所述雜交單鏈與所述單鏈DNA分子互補時還需滿足如下條件：所述雜交單鏈3'末端的核苷酸與所述單鏈DNA分子上的堿基甲互補，所述堿基乙與待聚合特定結構dNTP互補；

2）將所述單鏈DNA分子、所述雜交單鏈、所述特定結構dNTP和待測DNA聚合酶混合進行DNA聚合反應，并且以所述單鏈DNA分子作為延伸模板，檢測是否能成功聚合，若能成功聚合，則所述待測DNA聚合酶能聚合所述特定結構dNTP，若不能成功聚合，則所述待測DNA聚合酶不能聚合所述特定結構dNTP；

所述檢測是否能成功聚合的方法如下：

（1）當所述特定結構dNTP為熒光修飾dNTP，若聚合反應有熒光信號，則所述待測DNA聚合酶能聚合所述熒光修飾dNTP；

（2）當所述特定結構dNTP為無熒光修飾且3’端自由dNTP，向聚合反應后的體系中加入帶有熒光的另一dNTP和已知能聚合該另一dNTP且無外切活性的聚合酶，進行二次聚合反應，檢測二次聚合反應的熒光信號，若二次聚合反應有熒光信號，則所述待測DNA聚合酶能聚合該所述無熒光修飾且3’端自由dNTP；

所述帶有熒光的另一dNTP與所述單鏈DNA分子中的堿基丙互補配對，所述堿基丙位于所述堿基乙的上游且與所述堿基乙相鄰，且所述堿基丙和所述堿基乙不同；

（3）當所述特定結構dNTP為無熒光修飾且3’端阻斷dNTP，向聚合反應后的體系中加入帶有熒光的另一dNTP和已知能聚合該另一dNTP且無外切活性的聚合酶，進行二次聚合反應，檢測二次聚合反應的熒光信號，若二次聚合反應無熒光信號，則所述待測DNA聚合酶能聚合該所述無熒光修飾且3’端阻斷dNTP；

所述帶有熒光的另一dNTP與所述單鏈DNA分子中的所述堿基乙互補配對。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述聚合反應均在固定相上完成；

和，所述固定相具體為芯片。

3.根據權利要求1-2中任一所述的方法，其特征在于：

所述無外切活性的聚合酶為無3'-5’外切活性且高度保守的DNA聚合酶。

4.根據權利要求1-2中任一所述的方法，其特征在于：

所述單鏈DNA分子大小為10-200nt。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：

所述單鏈DNA分子大小為15-150nt。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：

所述單鏈DNA分子大小為20-100nt。

7.根據權利要求1-2中任一所述的方法，其特征在于：

所述特定結構dNTP中的dNTP為如下中至少一種：dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP；

若特定結構dNTP為多種dNTP，則制備多條雜交單鏈，且一種特定結構dNTP對應一條雜交單鏈。

8.權利要求1-7中任一所述的方法中的所述單鏈DNA分子、所述雜交單鏈、所述已知能聚合另一dNTP且無外切活性的聚合酶和所述帶有熒光的另一dNTP在檢測待測DNA聚合酶能否聚合特定結構dNTP中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：

所述特定結構dNTP為熒光修飾dNTP、無熒光修飾且3’端阻斷dNTP或無熒光修飾且3’端自由dNTP。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于：

所述dNTP為如下中至少一種：dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP。

11.一種檢測待測DNA聚合酶能否聚合特定結構dNTP的試劑盒，包括權利要求1-7中任一所述的方法中所述單鏈DNA分子、所述雜交單鏈、所述特定結構dNTP和所述已知能聚合另一dNTP且無外切活性的聚合酶。