[發明專利]脂肪酶基因、重組表達載體、重組表達菌株、脂肪酶及其制備方法、及生物柴油的制備方法

有效

• 申請號: 201710946454.1
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107815460B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 楊江科;尤遜
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/20;C12N15/81;C12N1/19;C12N15/66;C12P7/64;C12R1/84
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 胡海國

本發明公開一種脂肪酶基因、重組表達載體、重組表達菌株、脂肪酶及其制備方法、及生物柴油的制備方法，其中，所述脂肪酶基因TLLsyn用于編碼脂肪酶，所述脂肪酶基因TLLsyn的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發明提供的脂肪酶基因TLLsyn，采用了畢赤酵母中的高頻密碼子替換原有的低頻密碼子，顯著提高了人工合成的脂肪酶基因TLLsyn在畢赤酵母細胞中的表達量；此外，在脂肪酶的制備過程中，將人工合成的脂肪酶基因TLLsyn轉入到畢赤酵母中，并結合目的基因的多拷貝構建，提高了脂肪酶基因TLLsyn在脂肪酶中的表達量，并提高了脂肪酶的酶活，其制備工藝簡單且產量高，降低了脂肪酶的生產成本。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種脂肪酶基因、重組表達載體、重組表達菌株、脂肪酶及其制備方法、及生物柴油的制備方法。

背景技術

生物柴油是指以油料作物如大豆、油菜、棉、棕櫚等，野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及動物油脂、餐飲垃圾油等為原料油通過酯交換或熱化學工藝制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料，因其具有優良的環保特性而受到廣泛關注。生物柴油的制備方法包括化學法和生物酶合成法，其中生物酶合成法，是以動物油脂和低碳醇為原料，通過脂肪酶的催化作用進行轉酯化反應，制備相應的脂肪酸甲酯及乙酯，具有條件溫和、醇用量小、無污染排放的優點。

但是，目前適用于生物柴油轉酯反應催化的脂肪酶，因其表達量低而使得催化效率不高，且穩定性(最常見的是耐溫、耐酸堿)較差、要求反應條件苛刻，并不適用大規模生產生產柴油，而適用于生產生物柴油的脂肪酶因其技術門檻高，市場價格一直居高不下。

畢赤酵母真核表達系統是目前廣泛使用的真核生物表達系統，具有生物安全性好、遺傳元件穩定、高密度發酵工藝成熟、表達水平高以及目的蛋白分離純化簡便等優點，是異源蛋白中工業化生產的理想宿主。然而，由于受到畢赤酵母對異源基因密碼子使用偏好性、mRNA二級結構的復雜性、基因中富含A/T或G/C區段、蛋白酶切割位點以及基因在宿主中的豐度等因素影響，異源基因在畢赤酵母中難以獲得高效表達。

發明內容

本發明的主要目的是提出一種脂肪酶基因、重組表達載體、重組表達菌株、脂肪酶及其制備方法、及生物柴油的制備方法，旨在提高脂肪酶基因在脂肪酶中的表達量。

為實現上述目的，本發明提出一種脂肪酶基因TLLsyn，用于編碼脂肪酶，所述脂肪酶基因TLLsyn的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發明還提出一種脂肪酶，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發明還提出一種重組表達載體，包括如上述的脂肪酶基因TLLsyn。

優選地，所述脂肪酶基因TLLsyn的拷貝數為多個。

本發明還提出一種重組表達菌株，包括如上述的脂肪酶基因TLLsyn。

優選地，所述重組表達菌株的宿主細胞為畢赤酵母。

本發明還提出一種如上述的重組表達載體的制備方法，包括如下步驟：

將合成的脂肪酶基因TLLsyn通過酶切位點EcoR Ⅰ連接到中間載體pUC57，獲得pUC-TLLsyn載體；

將pUC-TLLsyn載體和pAO815載體分別用EcoR Ⅰ酶切，電泳、膠回收脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段；

將脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段通過T4DNA連接酶連接，獲得pAO815-TLLsyn重組表達載體。

本發明還提出一種如上述的重組表達菌株的制備方法，包括如下步驟：

將合成的脂肪酶基因TLLsyn通過酶切位點EcoR Ⅰ連接到中間載體pUC57，獲得pUC-TLLsyn載體；