[發明專利]一種臍帶膜保存和制備干細胞的方法

在審

• 申請號: 201710946198.6
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN109652362A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 黃慶雷;鄧鉞;沈麗
• 申請（專利權）人: 北京弘潤天源基因生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種從人臍帶最外表面覆蓋的羊膜層制備間充質干細胞的方法，分離培養時臍帶膜不需要貼壁處理，所分離的間充質干細胞比普通華通氏膠組織塊貼壁法純度更高。華通氏膠含有一定的成纖維細胞，其特性與間充質干細胞非常類似，難以純化。人羊膜只含有人羊膜上皮細胞和人羊膜間充質干細胞兩種細胞類型，上皮細胞貼壁能力強，傳代培養過程中容易去掉，從而獲得的間充質干細胞純度更高。本發明從臍帶最外表面覆蓋的羊膜層中提取間充質干干細胞，可有效的對臍帶組織進行長期冷凍保存，凍存液充分接觸臍帶膜，最大程度維持了臍帶膜兩側細胞的活性，且方便復蘇使用，尤其是復蘇后分離間充質干細胞，不需要臍帶膜組織塊的貼壁處理。

技術領域

本發明屬于干細胞制備技術領域，具體涉及一種人臍帶來源間充質干細胞的制備方法，尤其涉及從臍帶最外層羊膜中分離間充質干細胞。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)起源于發育早期的中胚層, 是一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。MSCs 具有免疫原性低、造血支持、炎癥趨化、免疫調節和提供營養支持等生物學特性，在組織損傷，免疫調控和再生醫學領域受到了廣泛的研究，具有廣闊的應用前景。

間充質干細胞具有很強的分化能力，除可分化為脂肪，骨、軟骨、骨骼肌和肌腱等中胚層細胞外，無論體內還是體外，在不同的誘導條件下，間充質干細胞還可分化為外胚層的神經細胞和內胚層的肝卵圓性細胞。臨床試驗表明，間充質干細胞可歸巢到組織損傷部位，參與多種組織的損傷修復。

間充質干細胞對固有免疫系統和獲得性免疫系統的多種免疫細胞都可以進行免疫調節。間充質干細胞主要通過旁分泌產生細胞因子、趨化因子和生長因子等生物活性物質以及細胞與細胞間的直接接觸等方式共同對靶細胞進行免疫調控，調控的細胞類型包括巨噬細胞，天然殺傷細胞，T細胞，B細胞，樹突狀細胞和單核細胞等多種細胞類型。間充質干細胞的免疫調節作用在移植物抗宿主病，自身免疫性疾病和預防器官移植免疫排斥等方面發揮重要的作用。

間充質干細胞最初在骨髓中發現，目前已經從多種組織中分離提取，例如臍帶，脂肪，牙髓，胎盤，羊水，肌肉，肺，肝和胰腺等組織中都能分離到間充質干細胞。臍帶來源的間充質干細胞有其獨特的優勢：增殖能力強，能快速滿足臨床需要的細胞數量；免疫原性低，異體移植不發生免疫排斥反應；采集方便，對供體無傷害，易于保存和運輸；提取和分離簡單，病毒污染概率低，細胞分離培養的純度高。

臍帶表面被羊膜覆蓋，呈白色，光滑而濕潤，有時局部表面會有一些隆起。在妊娠期間人臍帶連接母體和胎兒，為胎兒的發育提供營養，臍帶主要由三部分構成：羊膜被覆上皮、兩條臍帶動脈和一條臍帶靜脈血管以及位于上皮和血管之間的華通氏膠（Wharton'sJelly）結締組織。華通氏膠的主要成分是膠原、透明質酸、硫酸軟骨素（其中膠原占干重的50%以上，以I、II、III型膠原為主），含有豐富的間充質干細胞和少量的成纖維細胞。

臍帶間充質干細胞的來源包括：最外層的羊膜，羊膜下層，華通氏膠，臍帶動脈和靜脈血管周圍組織。血管周圍為含水量豐富的華通膠有保護臍帶血管的作用，也可分離提取到間充質干細胞。目前的制備方法中應用最為廣泛的是華通氏膠來源的間充質干細胞。此外，人羊膜所含的細胞類型包括人羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells）和人羊膜間充質干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells)兩種。