[發明專利]一種臍帶膜保存和制備干細胞的方法

在審

• 申請號: 201710946198.6
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN109652362A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 黃慶雷;鄧鉞;沈麗
• 申請（專利權）人: 北京弘潤天源基因生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種臍帶膜保存和制備干細胞的方法，包括以下步驟：

（1）臍帶膜的處理和冷凍保存方法：

1）臍帶的采集：經產婦知情同意，在產房無菌條件下，健康產婦胎兒娩出后即刻按產科常規結扎斷臍的方法截取不少于20cm長的臍帶，用臍帶清洗液沖洗臍帶，再用醫用酒精消毒，將臍帶置于臍帶保存盒中于2-8℃醫用取血箱恒溫保存，從母體抽取4ml外周血，用于病毒檢測；從胎盤端抽取4ml臍帶血，用于微生物檢測；

2）臍帶的運輸和接收：將母血檢測樣本、臍帶血檢測樣本和裝有臍帶的保存盒通過冷鏈運輸送達生物樣本庫的實驗室，為最大限度保證細胞的活性，樣本入庫時間越短越好，所有樣本要在48h內入庫，實驗室接收樣本后，將臍帶血和母血檢測樣本移交質控實驗室進行微生物檢測和病毒檢測；

3）臍帶膜的制備：待步驟2）中臍帶血和母血檢測樣本檢測合格后，將臍帶移交至制備實驗室，進行臍帶膜的分離制備，臍帶首先用75%的酒精進行消毒，然后用基礎平衡鹽溶液反復沖洗表面；用手術刀將臍帶切成2~3cm的小段，用鈍性鑷子剝離臍帶血管后，手術刀片刮去臍帶羊膜下層的華通氏膠，將臍帶膜切成0.5cm×0.5cm的片狀；

4）臍帶膜的凍存：步驟3）中制備好的臍帶膜，浸入2-8℃預冷的凍存保護液中，臍帶膜和凍存液按1:1的體積比裝入凍存管中，將凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序，將溫度降至-90℃后取出凍存樣本，放入液氮儲存罐長期保存；

（2）臍帶膜復蘇分離提取間充質干細胞：

5）臍帶膜的復蘇：將裝有臍帶膜的凍存管從液氮中取出后，置于37℃水浴鍋中解凍2-5分鐘，將臍帶膜用復蘇清洗液洗滌2-4次后接種至含有完全培養基的六孔板中；

6）間充質干細胞的原代培養：將接種臍帶膜組織片的六孔板置于37℃、含5%的CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，培養5天后首次進行半量換液，之后每3天換液一次，7-12天左右培養板底部可觀察到有細胞貼壁生長；

7）傳代培養：待原代細胞生長至細胞融合度80-90%后用含0.05~0.25%的胰蛋白酶進行消化，消化液經100目濾網過濾，去掉臍帶組織片，獲得含臍帶間充質干細胞的濾液，依次傳代培養，可獲得4-6代的臍帶間充質干細胞。

2.根據權利要求1所述的（1）臍帶膜的處理和冷凍保存方法，其特征是：步驟1）中所述臍帶清洗液包括磷酸鹽緩沖液、1%肝素鈉、3mmol/L的還原型谷胱甘肽、青鏈霉素、慶大霉素、兩性霉素B中的一種或幾種的組合。

3.根據權利要求1所述的，（1）臍帶膜的處理和冷凍保存方法，其特征是：步驟2）中所述臍帶保存盒，具有良好的密封性，保證運輸過程中低氧環境。

4.根據權利要求1所述的（1）臍帶膜的處理和冷凍保存方法，其特征是：步驟3）中所述臍帶膜，為臍帶羊膜層，具體分離方法為，固定臍帶組織片靠表皮一側，用鑷子撕下臍帶內側整齊的羊膜下層組織，再用手術刀掛去殘留的華通氏膠，剩下薄薄一層透明的臍帶膜即臍帶羊膜層組織。

5.根據權利要求1所述的（1）臍帶膜的處理和冷凍保存方法，其特征是：步驟4）中所述的凍存程序為：第一步4~12℃，等待；第二步0.8~1.2℃降至0~-4℃；第三步8-12℃降至-20~-30℃；第四步0.8~1.2℃降至-45~-55℃；第五步8~12℃降至-80~-90℃后，取出凍存樣本，轉移至液氮罐中長期保存。

6.根據權利要求1所述的（2）臍帶膜復蘇分離提取間充質干細胞，其特征是：步驟5）中所述的臍帶膜復蘇清洗液包括磷酸鹽緩沖液和間充質干細胞培養基。

7.根據權利要求1所述的（2）臍帶膜復蘇分離提取間充質干細胞，其特征是：步驟5）中所述的完全培養基包括含10%Gibco胎牛血清的低糖DMEM、干細胞因子SCF終濃度5-15ng/ml、成纖維細胞生長因子bFGF終濃度5-15ng/ml、人表皮細胞生長因子EGF終濃度5-15ng/ml、UltroserTMG（血清替代物）、UITRACULTURE(LONZA)基礎培養基中的一種或幾種的組合。

8.根據權利要求1所述的（2）臍帶膜復蘇分離提取間充質干細胞，其特征是：步驟5）中所述的完全培養基包括商品化的限定化學成分的培養基，包括Stem cell公司MesenCult?-XF Medium培養液或Lonza公司的 TheraPEAK? MSCGM-CD?間充質干細胞培養基。