[發明專利]一種人前列腺免疫優勢抗原的制備方法及其應用方法

在審

• 申請號: 201710944582.2
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107522780A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 陸金春
• 申請（專利權）人: 南京精競生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C07K14/47;G01N33/68;G01N33/535
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技術領域

本發明屬于生物學檢測技術領域，具體地，涉及一種人前列腺免疫優勢抗原的制備方法及其在人前列腺自身抗體檢測中的應用。

背景技術

前列腺炎是泌尿科常見的疾病，也是一個主要的醫學問題，據估計影響30％的男性，慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征(CP/CPPS)約占所有前列腺炎的90％，是50歲以下男性最常見的泌尿科診斷。缺乏感染下的會陰、直腸、前列腺、陰莖、睪丸和腹部疼痛以及炎癥為CP/CPPS患者的標志。CP/CPPS的病因尚不清楚，治療效果有限。一般認為，CP/CPPS的癥狀可能是心理因素、免疫、神經和內分泌系統功能障礙之間相互影響的結果，其可能與自身免疫過程有關。

在過去30年里，大量的工作一直在建立和定性實驗性自身免疫性前列腺炎不同嚙齒類動物模型，以研究CPPS的可能病理機制。這些模型證實用前列腺提取物免疫大鼠或小鼠可以誘導對前列腺抗原的T細胞和抗體應答，其與前列腺炎癥的組織學證據相關。但選擇不同鼠齡的大鼠有可能產生不同的結果；而且，大鼠或小鼠鼠系的不同，對自身前列腺抗原的細胞和體液應答能力和強度也不同。因此，動物模型實驗有可能低估了前列腺炎的體液自身免疫性應答。在男性中有關自身免疫性前列腺炎的證據極少。大部分研究顯示，CP/CPPS患者血清或精漿中有高水平的炎癥相關的細胞因子，如IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL6、IL-8、IL-13、TNF-α、IFNγ、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、血小板源生長因子BB(PDGF-BB)等。少部分研究用前列腺來源的特異物質如前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺類固醇結合蛋白(PSBP)、PSA免疫大鼠，成功誘導產生了顯著的前列腺炎，從而認為CPPS與自身免疫相關。但細胞因子的升高對自身免疫性前列腺炎的診斷缺乏特異性，而已知的幾種前列腺特異蛋白對動物的成功免疫難以證實臨床上自身免疫性前列腺炎患者的存在，且前列腺患者自身抗原的種類較多。但如果在患者血清中證實有抗人前列腺免疫優勢抗原的自身抗體的存在則可確定男性可發生自身免疫性前列腺炎

發明內容

發明目的：為了實現上述目的，本發明提供了一種人前列腺免疫優勢抗原的制備方法及其在人前列腺自身抗體檢測中的應用。

技術方案即：(1)人前列腺組織蛋白提純液的制備：將獲取的人前列腺良性增生組織置于冰磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01mmol/L，pH7.4)中，修剪掉脂肪、膀胱等多余的組織，再清洗5次，剪碎前列腺組織，加入含0.5％TritonX-100的生理鹽水，冰浴勻漿，12000r/min 4℃離心30min后，去除上層脂肪組織，獲得的上清液即為人前列腺組織蛋白提純液，用全自動化分析儀測定其總蛋白濃度后分裝保存(-80℃)。

(2)抗人前列腺組織抗原抗血清的制備及抗體效價檢測：首先對實驗兔通過后背皮內及皮下多點注射弗氏完全佐劑乳化的步驟(1)獲得的人前列腺組織蛋白提純液(蛋白濃度為0.5mg/ml)，每只實驗兔1ml；對照兔注射弗氏完全佐劑乳化的生理鹽水，每只1ml。家兔在第10、20、30天再次進行注射，最后一次注射后7天處死家兔，并收集家兔的所有血液，離心分離血清，血清凍存于-80℃備用。兔血清抗前列腺組織蛋白抗體效價通過ELISA法檢測，其效價為1:10000以上。

(3)人前列腺免疫優勢抗原的鑒定：首先將步驟(1)獲得的人前列腺組織蛋白提純液進行二維電泳，然后分別用步驟(2)獲得的實驗兔抗血清和對照兔血清進行免疫印跡，再對兩者的差異蛋白點進行質譜分析，共鑒定出16種前列腺免疫優勢抗原，其中3種蛋白——Semaphorin-7A、熱休克蛋白beta-1和主要組織相容性復合物2類抗原已被證實與前列腺疾病相關。Western印跡確定這些抗原主要存在于前列腺腺體上皮細胞的細胞膜和細胞質上。

(4)人前列腺免疫優勢抗原的純化：依次用飽和硫酸銨法和Protein A-Agarose層析柱從兔抗血清中純化出兔免疫球蛋白，然后將其交聯至CNBr活化的Sepharose層析柱上，將人前列腺組織蛋白提純液過此層析柱，通過結合和洗脫即可獲得純化的人前列腺免疫優勢抗原。

(5)建立檢測人前列腺自身抗體的ELISA法：將步驟(4)獲得的純化的人前列腺免疫優勢抗原包被聚苯乙烯酶標板(板條)，每孔包被人前列腺免疫優勢抗原50ng，血清樣本以1:10稀釋后加樣，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗人IgG為二抗。用TMB顯色液顯色10min，2mol/L硫酸終止反應。以P/N≥2.1判斷結果為陽性，從而建立人前列腺自身抗體的ELISA檢測法。