[發明專利]一種人前列腺免疫優勢抗原的制備方法及其應用方法

在審

• 申請號: 201710944582.2
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107522780A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 陸金春
• 申請（專利權）人: 南京精競生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C07K14/47;G01N33/68;G01N33/535
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• 代理人: 暫無信息

1.一種人前列腺免疫優勢抗原的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)人前列腺組織蛋白提純液的制備；

(2)抗人前列腺組織抗原抗血清的制備及抗體效價檢測；

(3)人前列腺免疫優勢抗原的鑒定；

(4)人前列腺免疫優勢抗原的純化。

2.根據權利要求1所述的人前列腺免疫優勢抗原的制備方法，其特征在于：所述人前列腺組織蛋白提純液的制備，包括以下步驟：

將人前列腺良性增生組織置于冰磷酸鹽緩沖液中，修剪掉多余的組織，所述多余組織包括脂肪、膀胱；

清洗5次，剪碎前列腺組織，加入含0.5％TritonX-100的生理鹽水，冰浴勻漿，12000r/min4℃離心30min后，去除上層脂肪組織，獲得的上清液即為人前列腺組織蛋白提純液，測定總蛋白濃度后分裝保存。

3.根據權利要求1所述的人前列腺免疫優勢抗原的制備方法，其特征在于：所述抗人前列腺組織抗原抗血清的制備，包括以下步驟：

弗氏完全佐劑乳化步驟(1)獲得的人前列腺組織蛋白提純液，對實驗兔通過后背皮內及皮下多點注射弗氏完全佐劑乳化的人前列腺組織蛋白提純液，蛋白濃度為0.5mg/ml，每只實驗兔1ml；對照兔通過后背皮內及皮下多點注射弗氏完全佐劑乳化的生理鹽水，每只1ml；

實驗兔和對照兔在第10、20、30天再次接受注射，最后一次注射后7天處死實驗兔和對照兔，并收集實驗兔和對照兔的所有血液，離心分離血清，血清凍存于-80℃備用。

4.根據權利要求3所述的人前列腺免疫優勢抗原的制備方法，其特征在于：所述抗體效價檢測通過酶聯免疫吸附分析法檢測，兔血清抗人前列腺組織蛋白抗體效價為1:10000以上。

5.根據權利要求1所述的人前列腺免疫優勢抗原的制備方法，其特征在于：所述人前列腺免疫優勢抗原的鑒定，包括以下步驟：

首先將步驟(1)獲得的人前列腺組織蛋白提純液進行二維電泳，然后分別用步驟(2)獲得的實驗兔抗血清和對照兔血清進行免疫印跡，再對兩者的差異蛋白點進行質譜分析，得所述人前列腺免疫優勢抗原。

6.根據權利要求5所述的人前列腺免疫優勢抗原的制備方法，其特征在于：所述人前列腺免疫優勢抗原包括Semaphorin-7A、熱休克蛋白beta-1和主要組織相容性復合物2類抗原。

7.根據權利要求1所述的人前列腺免疫優勢抗原的制備方法，其特征在于：所述人前列腺免疫優勢抗原的純化，包括以下步驟：依次用飽和硫酸銨沉淀法和Protein A-Agarose層析柱從兔抗血清中純化出兔免疫球蛋白，然后將其交聯至CNBr活化的Sepharose層析柱上，將人前列腺組織蛋白提純液過此層析柱，通過結合和洗脫即可獲得純化的人前列腺免疫優勢抗原。

8.根據權利要求1-7任一項所述的人前列腺免疫優勢抗原的應用方法，其特征在于：包括以下步驟：

純化的人前列腺免疫優勢抗原包被聚苯乙烯酶標板，每孔包被人前列腺免疫優勢抗原50ng，血清樣本以1:10稀釋后加樣，辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG為二抗；用TMB顯色液顯色10min，2mol/L硫酸終止反應。

9.根據權利要求8所述的人前列腺免疫優勢抗原的應用方法，其特征在于：將健康男性血清和/或慢性前列腺炎或慢性盆腔疼痛綜合征患者血清采用人前列腺自身抗體的ELISA檢測法進行檢測。