[發明專利]一種用于檢測KRAS基因突變的擴增引物、測序引物、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201710940794.3
• 申請日: 2017-10-11
• 公開（公告）號: CN107653304A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 李葆華;蔣析文;劉悅;甘小洪;馬道亮
• 申請（專利權）人: 廣州立菲達安診斷產品技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 廣州天河澤睿專利代理事務所(普通合伙)44430
• 代理人: 劉曉鈺

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，更具體地，本發明涉及一種用于檢測KRAS基因突變的擴增引物、測序引物、試劑盒和方法。

背景技術

結直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是目前世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，KRAS基因是人體腫瘤中常見的致癌基因，大約40％的結直腸癌患者伴有編碼KRAS基因區域的第2外顯子12號和13號密碼子突變，KRAS基因突變一般會使結直腸癌患者對EGFR抑制劑產生耐藥。根據《美國國立癌癥綜合網絡(NCCN)結直腸癌臨床實踐指南》，所有轉移性結直腸癌患者都應檢測KRAS基因狀態，只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑治療。因此KRAS基因突變檢測可為臨床醫生對結直腸癌患者腫瘤靶向藥物治療的選擇提供參考。

KRAS基因是ras基因家族中三種癌基因的一種，為表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)信號傳導通路的下游基因。KRAS基因位于12號染色體上，編碼具有GTP酶活性、分子量為21kD的蛋白，又稱為p21蛋白。在ras基因中，KRAS對人類癌癥影響最大，它好像分子開關：當正常時能控制調控細胞生長的路徑；發生異常時，則導致細胞持續生長，并阻止細胞自我毀滅。她參與細胞內的信號傳遞，當KRAS基因突變時，該基因永久活化，不能產生正常的ras蛋白，使細胞內信號傳導紊亂，細胞增殖失控而癌變。

西妥昔單抗和帕尼單抗是作用于KRAS的單克隆抗體，可以抑制下游的信號通路傳導。2008年6月,美國臨床腫瘤學會(ASCO)年會上CRYSTAL、OPUS等研究了西妥昔單抗聯合FOLFIRI和FOLFOX作為轉移性結直腸癌的初始治療作用，結論為：KRAS野生型患者在加用西妥昔單抗治療后PFS得到了顯著改善。若KRAS有突變，則無論單藥或聯合均不應使用西妥昔單抗或帕尼單抗，因為不僅無效，還增加副反應，浪費金錢。

KRAS基因的點突變主要集中在特定的氨基酸密碼子(第12、13、61、146密碼子)上，占所有突變的90％以上。KRAS基因突變可以導致細胞逃逸凋亡，這種在胰腺癌、大腸癌、肺癌中的發生率較高。在胰腺癌中，KRAS基因點突變發生率高達90％以上；而在大腸癌患者KRAS突變率為30％-35％；肺癌患者KRAS突變率為10-20％。檢測KRAS基因突變，對判斷這些腫瘤的發生和發展、預后以及了解腫瘤的治療效果具有一定意義。(1)正常人血檢中出現KRAS基因異常，提示屬于腫瘤高危人群；(2)良性腫瘤患者若是檢出KRAS基因突變，提示有惡變的可能；(3)大量研究表明，KRAS基因突變陽性，即使病理組織學診斷淋巴結轉移陰性，癌癥復發的可能性也很高；(4)無KRAS基因突變的肺癌、結直腸癌等腫瘤患者，經抗EGFR靶向藥物治療療效明顯，因此，通過檢測KRAS基因突變狀態可以篩選用藥人群，實現腫瘤患者的個體化治療，延長患者生存期。

雙脫氧終止法是上個世紀70年代由弗雷德·桑格爾發明的，他因此于1980年再度獲得了諾貝爾獎。2001年，Allan Maxam和Walter Gibert發明了Sanger測序法。并在此后成為基因檢測的金標準。Sanger測序利用雙脫氧終止法，即在Sanger測序反應中，利用堿基互補的原則合成新的DNA鏈，然而在測序引物延伸的過程中，如果遇到帶有熒光標記的雙脫氧核苷酸(ddNTP)時，DNA的合成就會終止，產生長短不一，帶有熒光標記的DNA片段。復制的DNA片段帶有負電荷，在毛細管電泳中會朝正極移動。不同長度的片段移動速度不同，因此到達檢測窗口的時間也不同。當DNA片段通過檢測窗口時，被標記的ddNTP的熒光被激活產生不同顏色的信號，從而讀取原始DNA序列上每個位置的堿基序列。