[發明專利]一種用于檢測KRAS基因突變的擴增引物、測序引物、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201710940794.3
• 申請日: 2017-10-11
• 公開（公告）號: CN107653304A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 李葆華;蔣析文;劉悅;甘小洪;馬道亮
• 申請（專利權）人: 廣州立菲達安診斷產品技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 廣州天河澤睿專利代理事務所(普通合伙)44430
• 代理人: 劉曉鈺

1.一種用于檢測KRAS基因突變的擴增引物，其特征在于，所述擴增引物具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的堿基序列。

2.一種用于檢測KRAS基因突變的測序引物，其特征在于，所述測序引物具有如SEQ ID No:3所示的堿基序列。

3.一種檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的擴增引物和權利要求2所述的測序引物。

4.根據權利要求3所述的檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括UNG(UDG)/dUTP體系。

5.根據權利要求4所述的檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括熱啟動Taq酶。

6.根據權利要求5所述的檢測KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括質控品，所述質控品為Kras陰性質控品、Kras野生型陽性質控品、Kras12號密碼子突變型陽性質控品、和Kras13號密碼子突變型陽性質控品。

7.一種檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于，使用權利要求3～6任一項所述的試劑盒進行檢測，包括以下步驟：

(1)、提取、純化待測樣品中的DNA；

(2)、以上述DNA作為模板，利用擴增引物進行PCR擴增，獲得擴增產物，純化擴增產物；

(3)、利用測序引物對上述PCR擴增產物進行測序PCR反應，對測序PCR反應后的產物進行Sanger測序，確定KRAS基因突變位點。

8.根據權利要求7所述的檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于，步驟(2)中所述PCR擴增的反應體系為：KRAS PCR反應液37ul、酶反應液3ul、模板10ul；所述PCR擴增的反應程序為：50℃2min；95℃15min預變性；94℃30s、55℃30s、72℃45s，40個循環；72℃7min，所述KRAS PCR反應液包括10X PCR buffer 5ul、25mM MgCl₂ 0.5ul、25mM dNTPs 1ul、H₂O 30.5ul；所述酶反應液包括UNG酶0.1ul、熱啟動Tag酶0.5ul，余量為超純水和甘油。

9.根據權利要求7所述的檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于，步驟(3)中所述測序PCR反應的反應體系為：PCR擴增產物10-50ng、BigDye 2ul、BigDye Sequencing Buffer 3ul、測序引物1ul、無菌純化水加至20ul；所述測序PCR反應的反應程序為：96℃1min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25個循環；4℃保溫。