[發明專利]三倍體湘云鯽尾鰭細胞系3nFC及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201710938834.0
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107641612A
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 馮浩;劉少軍;傅永明;肖軍;肖俊;周維;彭靈芝;吳慧
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 長沙朕揚知識產權代理事務所(普通合伙)43213
• 代理人: 楊斌

技術領域

本發明屬于魚類發育領域，尤其涉及一種三倍體湘云鯽尾鰭細胞系3nFC及其構建方法和應用。

背景技術

湖南師范大學生命科學學院魚類發育生物學研究室以紅鯽(Carassius auratas red.Var,2n＝100)為母本、湘江野鯉(Cyprinus carpio,2n＝100)為父本進行雜交，子一代(F1)中發現部分可育后代。通過F1自交獲得二倍體后代F2；將F2自交得到了F3。F3為雌雄均可育、染色體數目為200條的異源四倍體。該異源四倍體鯽鯉群體雌雄可育且能穩定的產生二倍體配子，使得四倍體特征能夠連續穩定遺傳。以異源四倍體鯽鯉為父本，二倍體日本白鯽為母本，通過倍間交配方法制備出染色體數目為150的三倍體湘云鯽(3n＝150)。三倍體湘云鯽的性腺根據其結構特征可被分成三種：卵巢型、精巢型和脂肪型；三倍體湘云鯽的三種性腺均不能產生可育的配子，繁殖和養殖實踐也證明了其完全不育性。由于三倍體湘云鯽具有生長速度快、抗病性強、抗逆性強及完全不育的優點，已經在全國得到推廣養殖，產生了顯著的經濟效益和社會效益。

改良三倍體湘云鯽(湘云鯽2號)是改良四倍體鯽鯉和改良三倍體湘云鯽進行交配產生的一種新型三倍體鯽魚。與傳統三倍體湘云鯽相比，改良三倍體鯽魚不但保留了三倍體魚生長速度快、不育等特點，而且在體形方面表現出明顯的改良特征。

近年來對改良三倍體湘云鯽以及改良三倍體鯽魚的水產養殖研究表明兩種魚都具有生長速度快，肉質好，抗逆性強等方面的優勢，這為其在全國范圍內推廣奠定了堅實的基礎。改良三倍體湘云鯽較其母本(改良二倍體紅鯽)和父本(四倍體鯽鯉)具有更強的抗病能力，這已經在生產實踐中得到了驗證，但目前缺乏與抗病性能力相關的理論依據。因此建立合適的體外研究細胞系，并利用其深入探究三倍體魚抗病能力強的生物學學機制是十分有意義的。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，針對目前研究三倍體魚抗病機制缺乏合適的體外細胞系，而提供一種三倍體湘云鯽尾鰭細胞系3nFC及其構建方法和應用。

為解決上述問題，本發明一方面提供了一種三倍體湘云鯽尾鰭細胞系3nFC，其保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：C201732。

本發明另一方面提供了一種三倍體湘云鯽尾鰭細胞系3nFC的構建方法，主要包括以下步驟：

(1)從三倍體湘云鯽尾鰭進行取材，消毒漂洗后剪成尾鰭組織小塊；

(2)將步驟(1)后得到的尾鰭組織小塊用胎牛血清浸泡后，在DMEM培養基中進行原代培養；

(3)待步驟(2)后得到的細胞生長至形成單層后，加入胰酶進行消化，終止消化后進行傳代培養。

上述的構建方法，優選的，所述構建方法具體包括以下步驟：

(1)用體積濃度為70％～75％的酒精對要取材的三倍體湘云鯽尾鰭進行消毒后，剪取尾鰭組織，用70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸緩沖液漂洗后剪成0.5～1mm²的尾鰭組織小塊；

(2)將步驟(1)后得到的尾鰭組織小塊用磷酸緩沖液清洗，進行離心，去上清，再用磷酸緩沖液重復清洗，加入尾鰭組織小塊5～10倍體積的胎牛血清浸泡15～30min，進行離心，去上清后，將得到的尾鰭組織小塊均勻接種于培養皿底部，25℃下倒置干貼0.5～2h，往培養皿中加入DMEM培養基，置于25℃且含體積5％CO₂的培養箱中培養；

(3)當細胞生長至形成單層后，去除培養皿中的培養基并加入磷酸緩沖液潤洗細胞，去除磷酸緩沖液，加入質量濃度0.25％的胰酶消化，除去胰酶，加入DMEM培養基終止消化，用移液器輕輕吸打使細胞充分分離，以1：1.5～2的細胞數量比進行傳代，然后仍置于培養箱中繼續培養，待其再次長至單層后，依照上述方法再進行傳代培養，將得到的三倍體湘云鯽尾鰭細胞系3nFC進行細胞凍存和細胞復蘇。